Töö tüüp:

Meditsiin, kehaline kasvatus, tervishoid

• Failiformaat:

  Faili suurus:

Ensüümi immuunanalüüsi põhimõtted, ELISA peamised tüübid, rakendamine diagnostikas

Saate teada õpilastöö kirjutamisel abistamise maksumuse.

Aidake paberi kirjutamisel, mis kindlasti vastu võetakse!

osariik haridusasutus erialane kõrgharidus

Vene riik meditsiiniülikool

Föderaalne Tervise- ja Sotsiaalarengu Agentuur

abstraktne

"Ensüümide immuunanalüüsi põhimõtted, ELISA peamised tüübid, rakendamine diagnostikas"

Samoilikov Pavel Vladimirovitš

intern kliinikumi osakonnas laboratoorne diagnostika»

Ensüümi immuunanalüüsi põhimõtted, ELISA peamised tüübid, rakendamine diagnostikas.

Sissejuhatus.

Immunoanalüüsi meetodeid on meditsiinipraktikas laialdaselt kasutatud. Kõigis kaasaegse meditsiini valdkondades immuunanalüüs, peamiselt diagnostilistel ja analüütilistel eesmärkidel. Eriti oluline on, et need võimaldaksid tuvastada bioloogilisi komponente (hormoonid, ensüümid, neuropeptiidid, tooted immuunsussüsteem, antigeenid jne) madalates ja väga madalates kontsentratsioonides. Nende meetoditega tuvastatakse kõik tooted, mille vastu on võimalik antikehi saada.

Immunoanalüüs põhineb antigeeni (AG) ja antikeha (AT) koostoimel erinevaid valikuidühe komponendi (ensüüm, radionukliid, fluorestsentsvärv ja teised) märgistamine. Reaktsiooni hindamine toimub automaatselt spetsiaalse seadmega, mis võimaldab neid meetodeid standardida.

Sõltuvalt kasutatava märgise tüübist ja testi seadistamise tingimustest nimetatakse immuunanalüüsi ensüümi immuunanalüüsiks (ELISA), radioimmunoanalüüsiks (RIA), immunofluorestsentsanalüüsiks ja teisteks. Kui reaktsioonid on lavastatud ühes või mitmes etapis, nimetatakse neid otsesteks või kaudseteks. Oluline on keskkond, milles reaktsioon läbi viiakse. Kui reaktsioon viiakse läbi pinnale fikseeritud reagentidega, nimetatakse katset tahkefaasiliseks testiks, näiteks ELISA (ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs).

Selles artiklis käsitletakse ainult ensüümi immuunanalüüsi - meetodit, mida kasutatakse laialdaselt bioloogias ja meditsiinis, nii praktilises kui ka fundamentaalses mõttes.

Seotud immunosorbentanalüüs.

ELISA ilmus 60. aastate keskel ja töötati algselt välja meetodina antigeeni tuvastamiseks histoloogilises preparaadis, samuti sademete joonte visualiseerimiseks immunodifusioonitestis ja immunoelektroforeesis ning seejärel hakati seda kasutama antigeenide ja antigeenide kvantitatiivseks määramiseks. antikehad bioloogilistes vedelikes. Meetodi väljatöötamises osalesid E. Engvall ja R. Pelman, samuti neist sõltumatult W. Van Veeman ja R. Schurs.

Joonis 1. ELISA põhiprintsiip.

1) Antigeenide tuvastamiseks. 2) Antikehade tuvastamiseks.

Meetod põhineb antikeha spetsiifilisel seondumisel antigeeniga, kusjuures üks komponentidest on konjugeeritud ensüümiga, reaktsiooni tulemusena vastava kromogeense substraadiga moodustub värviline saadus, mille kogust saab määratakse spektrofotomeetriliselt (joonis 1).

Antigeenide ja antikehade immobiliseerimise võimaluse avastamine erinevatel kandjatel, säilitades samal ajal nende seondumisaktiivsuse, on võimaldanud ELISA kasutamist laiendada erinevates bioloogia ja meditsiini valdkondades.

Monoklonaalsete antikehade ilmumine oli ELISA edasiarendus, mis võimaldas suurendada selle tundlikkust, spetsiifilisust ja tulemuste reprodutseeritavust.

Teoreetiliselt põhineb ELISA kaasaegse immunokeemia ja keemilise ensümoloogia andmetel, antigeeni-antikeha reaktsiooni füüsikalis-keemiliste seaduspärasuste tundmisel, aga ka analüütilise keemia põhiprintsiipidel. ELISA tundlikkuse ja selle kestuse määravad mitmed peamised tegurid: antigeeni-antikeha reaktsiooni kineetilised ja termodünaamilised omadused, reaktiivide suhe, ensüümi aktiivsus ja selle tuvastamismeetodite lahutusvõime. Üldiselt saab antigeen-antikeha reaktsiooni kirjeldada lihtsa skeemi abil:

+[AG]↔[ATAG]

Uurimisobjektide mitmekesisus alates madala molekulmassiga ühenditest kuni viiruste ja bakteriteni, samuti ebatavaliselt suur hulk ülesandeid, mis on seotud ELISA kasutamise erinevate tingimustega, määravad selle meetodi äärmiselt suure hulga variantide väljatöötamise. .

Iga ELISA variant sisaldab 3 kohustuslikku etappi:

1. uuritava ühendi äratundmise staadium sellele spetsiifilise antikeha poolt, mis viib immuunkompleksi moodustumiseni;

2. konjugaadi seose moodustumise staadium immuunkompleksi või vabade sidumissaitidega;

3. ensüümi märgise registreeritud signaaliks muutmise etapp.

ELISA klassifikatsioon.

ELISA meetodite klassifikatsioon põhineb mitmel lähenemisviisil:

1. ELISA esimeses etapis esinevate reaktiivide tüübi järgi eristatakse konkureerivaid ja mittekonkureerivaid meetodeid.

A) Konkureerivas ELISA-s sisaldab süsteem esimeses etapis nii analüüsitavat ühendit kui ka selle analoogi, mis on märgistatud ensüümiga ja konkureerib sellega spetsiifiliste seondumiskohtade pärast.

B) Mittekonkureerivate meetodite puhul on süsteemis esimeses etapis iseloomulik ainult analüüsitava ühendi ja sellele spetsiifiliste sidumiskeskuste olemasolu.

2. Kõik ELISA meetodid jagunevad homogeenseteks ja heterogeenseteks.

Kui ELISA kõik kolm etappi viiakse läbi lahuses ja põhietappide vahel puuduvad täiendavad moodustunud immuunkomplekside eraldamise etapid reageerimata komponentidest, kuulub meetod homogeensete hulka.

Homogeense ELISA, mida tavaliselt kasutatakse madala molekulmassiga ainete määramiseks, aluseks on ensüümi aktiivsuse pärssimine, kui see kombineeritakse antigeeni või antikehaga. Ensüümi aktiivsus taastub antigeen-antikeha reaktsiooni tulemusena.

Kui antikeha seondub ensüümi märgist sisaldava antigeeniga, inhibeeritakse ensüümi aktiivsust 95% kõrge molekulmassiga substraadi suhtes, mis on tingitud substraadi steerilisest välistamisest ensüümi aktiivsest keskusest. Antigeeni kontsentratsiooni suurenedes seondub rohkem antikehi ja säilib rohkem vabu antigeen-ensüümi konjugaate, mis suudavad hüdrolüüsida suure molekulmassiga substraati. Analüüs tehakse väga kiiresti, ühe määramise jaoks kulub 1 minut. Meetodi tundlikkus on üsna kõrge. Selle abil saate aine määrata pikomoolide tasemel.

Heterogeensete meetodite puhul on tüüpiline analüüs läbi viia kahefaasilises süsteemis, milles osaleb tahke faas - kandja ja immuunkomplekside eri faasides (moodustunud) reageerimata komponentidest eraldamise kohustuslik etapp (pesemine). immuunkompleksid on tahkel faasil ja reageerimata kompleksid on lahuses). Heterogeenseid meetodeid, mille puhul immuunkomplekside moodustumine esimeses etapis toimub tahke faasi alusel, nimetatakse tahkefaasi meetoditeks.

Meetodid klassifitseeritakse homogeenseteks-heterogeenseteks, kui 1. etapp - spetsiifiliste komplekside moodustumine toimub lahuses ja seejärel kasutatakse komponentide eraldamiseks tahket faasi immobiliseeritud reagendiga.

3. Vastavalt uuritava aine määramise põhimõttele:

A) Aine (antigeeni või antikeha) kontsentratsiooni otsene määramine sellega interakteeruvate sidumiskeskuste arvu järgi. Sel juhul on ensüümi märgis saadud spetsiifilises AG-AT kompleksis. Analüüdi kontsentratsioon on otseselt võrdeline registreeritud signaaliga.

B) Aine kontsentratsiooni määramine sidumissaitide koguarvu ja järelejäänud vabade seondumiskohtade erinevuse järgi. Sel juhul suureneb analüüdi kontsentratsioon ja salvestatud signaal väheneb, seega on sel juhul pöördvõrdeline sõltuvus salvestatud signaali suurusest.

ELISA-s kasutatud komponentide omadused.

Ensüümid.

Ensüümimärgistel on äärmiselt võimas katalüütiline toime, üks ensüümi molekul võib reageerida suure hulga substraadimolekulidega. Seega saab tühistes kogustes esinevat ensüümi tuvastada ja kvantifitseerida saaduste moodustumise ehk reaktsiooni kaudu, mida see katalüüsib. Ensüümide märgistusena kasutamise eeliseks on ka arvukate funktsionaalrühmade (sulfhüdrüül-, karboksüül-, türasiinijäägid jne) olemasolu molekulis, mille kaudu saab ligandimolekule kovalentselt siduda.

ELISA-s kasutatavatel ensümaatilistel markeritel peaksid olema järgmised omadused:

– ensüümi kõrge aktiivsus ja stabiilsus analüüsitingimustes, modifitseerimise ajal ja konjugatsioonis antikehade või muude valkudega;

– tundlike substraatide olemasolu ja ensümaatilise reaktsiooni produktide või substraatide määramise meetodi lihtsus;

– substraadisüsteemide kohandamise võimalus edasiseks tugevdamiseks;

- ensüümi ja selle inhibiitorite puudumine uuritavas bioloogilises vedelikus.

ELISA abil saab kasutada vähemalt 15 erinevat ensüümi. Ülaltoodud nõuete kohaselt on suurimaks kasutuseks mädarõika peroksidaas (HRP), aluseline fosfataas (AP) ja β-D-galaktosidaas (tabel 1). Kõik kolm on stabiilsed ja katalüüsivad väga tundlikke reaktsioone. Lisaks saab nende ensüümide poolt katalüüsitavate reaktsioonide saadusi olenevalt kasutatavast substraadist tuvastada mitte ainult kolorimeetriliste meetoditega, vaid ka fluorestsentsmeetoditega. Teisi ensüüme kasutatakse palju harvemini. See on seletatav nende madalama spetsiifilise aktiivsusega võrreldes HRP ja AP-ga.

Substraadid.

Substraadi valiku määrab eelkõige märgisena kasutatav ensüüm, kuna ensüümi-substraadi reaktsioon on väga spetsiifiline.

Põhinõuded aluspinnale:

– meetodi kõrge tundlikkuse tagamine ensüümi tuvastamisel konjugaadis;

– ensüüm-substraadi reaktsiooni täpselt määratletud (näiteks värviliste) produktide moodustumine;

– aluspind peab olema ohutu, odav, ligipääsetav ja mugav kasutada.

Tabel 1.

	Kviitungi allikas			Konjugeeriv reaktiiv
mädarõika peroksidaas	Mädarõigas (Armoracia rusticana)		O-fenüleendiamiindivesinikkloriid (OPD, 492 nm) 5-aminosalitsüülhape (450 nm), diaminobensidiin, o-dianisidiin.	Glutaraldehüüd Meta-perjodaadi naatrium N-suktsiinimidüül-3 (2-püridüülditio)propionaat
β-D-galaktosidaas			O-nitrofenüül-β-D-galaktosiid (420 nm)	Meta-maleimidobenseen-N-hüdroksüsuktsiinimiidi ester
Leeliseline fosfataas	E. coli, vasika soole limaskest		P-nitrofenüülfosfaat (405 nm), 5-bromo-4-kloro-3-indolüülfosfaat	Glutaraldehüüd

Sagedamini kasutatakse kromogeenseid substraate, mis hävitamisel moodustavad värvilise aine. Paljutõotav on kõrge energiaga substraatide kasutamine - fluorestseeruvad, kemoluminestsents. Selliste substraatide kasutamine võimaldab teoreetiliselt tõsta ELISA tundlikkust kahe suurusjärgu võrra.

Antigeenid ja antikehad.

ELISA-s kasutatavad AG ja AT peaksid olema kõrgelt puhastatud ja väga aktiivsed. Lisaks peaks AG-l olema kõrge antigeensus, optimaalne tihedus ja antigeensete determinantide arv, võõras ja homogeensus. Paljud sünteetilised ja rekombinantsed viiruste ja bakterite antigeenid on end ELISA-s kasutades hästi tõestanud. See suurendas oluliselt meetodi spetsiifilisust ja reprodutseeritavust, minimeerides ristreaktsioone.

ELISA üks olulisemaid reaktiive on antikehad. ELISA tundlikkus sõltub kasutatavate antikehade kontsentratsioonist, aktiivsusest ja spetsiifilisusest. Kasutatavad antikehad võivad olla polü- või monokliinsed, erineva klassi (IgG või IgM) ja alamklassiga (IgGl, IgG2), anti-allotüüpsed või anti-idiotüüpsed. Madala AT afiinsuse korral viib AG-AT kompleksi lagunemine seotud AG eemaldamiseni süsteemist. Meetodi tundlikkust ja spetsiifilisust suurendab monoklonaalsete antikehade kasutamine. Sel juhul on võimalik tuvastada uuritavates proovides AG (AT) madalaid kontsentratsioone.

Konjugaadi moodustumine

Konjugaat on ensüümmärgisega märgistatud antigeen või antikeha. Konjugaadi moodustamine on ELISA üks olulisi etappe.

Konjugaadi moodustamisel valitakse selline optimaalne meetod ensüümi märgistuse sisestamiseks nii, et konjugaadi mõlemad komponendid säilitaksid oma bioloogilise aktiivsuse: ensüüm - võime suhelda substraadiga ja antigeen või antikeha - antigeensus ja antigeeniga seondumine. tegevust vastavalt. Märgistatud kõrgelt puhastatud antigeeni olemasolu võimaldab kasutada konkureerivaid meetodeid. Sel juhul saab lõppfaasis mõõta immobiliseeritud antikehadega seondumata konjugaadi aktiivsust, mis väldib pesemisprotseduuri ja muudab analüüsi mugavamaks. Antigeenid on aga oma füüsikalis-keemiliste omaduste ja struktuuri poolest mitmekesised, mistõttu on võimatu välja töötada universaalseid meetodeid antigeeniga konjugaadi saamiseks. Sel juhul on antigeen-ensüümi konjugaadi saamine eraldi väljakutse. Märgistatud antikehade valmistamine ELISA jaoks on metoodiliselt paremini kättesaadav.

Ensüümi konjugeerimine immunokeemiliselt aktiivsete valkudega toimub erinevate meetoditega: keemiline ristsidumine, ensüümi molekuli kovalentne sidumine AG või AT-ga ja ühendite moodustumine mittekovalentsete sidemete kaudu, näiteks siis, kui ensüüm ja AG või AT viiakse läbi immunoloogiliselt antigeeni-antikeha interaktsiooni kaudu.

Kõige laialdasemalt kasutatavad kovalentsed meetodid konjugaatide valmistamiseks. Sidumisreaktsiooni valiku määrab nendes valgusmolekulides saadaolevate funktsionaalrühmade tüüp. Glutaraldehüüdi, naatriumperjodaati jne kasutatakse reagentidena, mida kasutatakse ensüümi viimiseks antigeeni- ja antikehamolekulidesse.

Konjugaatide saamiseks glutaaraldehüüdi abil on olemas ühe- ja kaheetapilised meetodid. Võib moodustada erineva suurusega konjugaate, millel on vähenenud ensümaatiline aktiivsus (15–60% vabast ensüümist). Saadud konjugaat suured suurused võib steeriliselt takistada uuritava aine määramist. Suhteliselt madala molekulmassiga konjugaadid koosnevad Fab fragmendist ja ühest ensüümi molekulist.

Kaheetapilise sünteesi tulemusena, mis seisneb esmalt ristsiduva ainega modifitseeritud ensüümi etapiviisilises valmistamises, selle eraldamises ja seejärel selle järgnevas interaktsioonis antigeeniga (antikehaga), moodustuvad ensüümi molekulid. moodustuvad homogeensed koostised, mis sisaldavad 1-2 ensüümi molekuli immunoglobuliini molekuli kohta ning säilitavad kõrge ensümaatilise ja immunoloogilise aktiivsuse. Selliste konjugaatide hulk on aga väike (mädarõika peroksidaasi puhul 5–10%).

Suurim praktiline kasutamine leidis meetodi immunoperoksidaasi konjugaatide saamiseks, mis põhineb ensüümi süsivesikukomponendi oksüdeerimisel naatriumperjodaadiga (peroksidaasi seondumine konjugaadiga ulatub 70-90% ensüümi esialgsest kogusest).

Usaldusväärsel konjugaadil peavad olema järgmised omadused:

Kõrge antikehade tiiger ja kõrge afiinsus antigeeni suhtes, nii et seda saab kasutada suures lahjenduses ja seega vähendada mittespetsiifilist seondumist;

Piisav spetsiifilisus tööaretuses;

Monomeersete vormide ülekaal polümeersete üle, sest polümeersed vormid kipuvad plastiga mittespetsiifiliselt kleepuma, mille tulemuseks on reaktsiooni kõrge tausttase;

Optimaalne molaarsuhe ensüümi ja antikehade vahel (optimaalne suhe on umbes 1:1);

Konjugaadi piisav ensümaatiline aktiivsus. Selle omaduse määravad peamiselt konjugatsiooni tingimused ning ensüümi ja antikeha molekulide suhe konjugaadis.

tahke faas

ELISA jaoks võib tahke faasina kasutada erinevaid materjale: polüstüreeni, polüvinüülkloriidi, polüpropüleeni ja muid aineid. Tahkeks faasiks võivad olla katseklaasi seinad, 96 süvendiga ja muud plaadid, pallid, helmed, aga ka nitrotselluloos ja muud membraanid, mis aktiivselt valke absorbeerivad.

Antigeeni või antikehade immobiliseerimine tahkel faasil on võimalik kolmel viisil:

– passiivne adsorptsioon, mis põhineb tugevatel hüdrofoobsetel interaktsioonidel valkude ja sünteetilise pinna vahel;

– kovalentne kinnitumine tahke faasi külge;

– immunokeemiline jne (mittekovalentne ja mitteadsorptsioonkinnitus).

Valkude passiivset adsorptsiooni kasutatakse laialdaselt ELISA läbiviimisel tiitrimisplaatidel, nitrotselluloosmembraanidel. Passiivne adsorptsioon järgib küllastuse põhimõtet ja korreleerub adsorbeeritud aine molekulmassiga. Erinevat tüüpi membraanide (nitrotselluloos, nailon jne) adsorptsioonipind on 100-1000 korda kõrgem kui plastil.

Polüsahhariididel ja kõrgelt glükosüülitud valkudel on sageli madal afiinsus polüstüreeni suhtes. Nende immobiliseerimiseks on vaja muid meetodeid, näiteks kovalentset kinnitamist glutaaraldehüüdiga. Kovalentne kinnitus on efektiivne, kui tahke faasina kasutatakse hüdrofiilseid helmeid (agaroos) ja polüstüreenhelmeid.

Immunokeemilised meetodid põhinevad eelnevalt adsorbeeritud "lõksu" antikehade kasutamisel antigeeni või antikehade immobiliseerimiseks. Immunokeemiliselt immobiliseeritud antigeen on 10 korda aktiivsem kui passiivselt adsorbeeritud antigeen. Võib kasutada lektiine või bakterite immunoglobuliini siduvaid valke, mis on kergesti adsorbeeruvad plastile või muudele hüdrofoobsetele pindadele, nagu konkanavaliin A (Con A) või stafülokoki valk A. Con A on võimeline immobiliseerima HIV viiruse gp 120 valku.

Tahke faasi pinnal olevad vabad kohad, mis ei ole sorbeeritud ainega seondunud, võivad testi käigus fikseerida teisi molekule, sealhulgas konjugaate, mis viib taustsignaali suurenemiseni. Et vältida mittespetsiifilist seondumist pärast immobiliseerimist alusmaterjali tahkele faasile, töödeldakse ainetega, mis on testi jaoks neutraalsed. Kõige populaarsemad blokeerivad ained on veise seerumi albumiin (BSA), kaseiin jne. Blokeeriva aine valik ja selle etapi tingimused sõltuvad tahke faasi tüübist ja süsteemi tundlikkusest.

ELISA lavastusvõimalused.

Üldine põhimõte.

Hetkel kasutusel suur summa erinevad ELISA tüübid ja modifikatsioonid. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) erinevad variandid on laialt levinud.

Tahkefaasiline ELISA pakuti välja 1971. aastal. Tahkefaasilise ELISA põhiprintsiibid, olenemata modifikatsioonist, on järgmised:

1. Reaktsiooni 1. etapis adsorbeeritakse antigeenid või antikehad tahkele faasile. Sel juhul on tahke faasiga mitteseotud reagendid kergesti eemaldatavad pesemisega.

2. Uuritavat proovi inkubeeritakse sensibiliseeritud süvendites. Positiivse kontrolli süvendid sisaldavad standardseid reaktiive. Sel juhul moodustuvad immuunkompleksid tahke faasi pinnal. Seondumata komponendid eemaldatakse pesemise teel.

3. Antikeha-ensüümi või antigeen-ensüümi konjugaadi lisamisel ja sidumisel immobiliseeritud immuunkompleksiga jääb ensüümi aktiivne sait kättesaadavaks järgnevaks interaktsiooniks substraadiga. Substraadi inkubeerimine süvendites immobiliseeritud konjugaadiga viib värvireaktsiooni tekkeni. Selle reaktsiooni saab peatada soovitud etapis, värvumise raskust saab hinnata visuaalselt või optilise tiheduse järgi.

Tahkefaasianalüüsi mis tahes variandi oluline etapp on seondumata reaktiivide mahapesemise protseduur. Oluline on mitte ainult loputada tahkele faasile kinnitatud komponente, vaid eemaldada reaktiivid kogu kihi sügavusest. Need on analüüsi kõige aeganõudvamad ja töömahukamad etapid. Proove saab pesta automaatselt spetsiaalse seadmega – pesumasinaga või käsitsi, mitme kanaliga pipetiga. ELISA läbiviimiseks vajate:

– kasutatud polüstüreentabletti või muid tahke faasi valikuid;

- pesulahus;

– konjugaat (ensümaatiliselt märgistatud antigeenid või antikehad);

– kasutatud substraatide segu;

- seiskamislahus (Stop reagent – ​​lahus reaktsiooni peatamiseks);

- positiivseks ja/või negatiivseks kontrolliks kasutatud proovid;

– standardantigeen (kalibreerimiskõvera koostamiseks);

– ühe- ja mitmekanalilised pipetid;

– pesumasin (seib);

– optiline seade uuritava lahuse optilise tiheduse määramiseks (ELISA lugeja, kõiki süvendeid järjestikuliselt fotomeetriv lugeja);

- 5-100 µl uuritud bioloogilist materjali.

Otsene ELISA

1. Antigeenid või antikehad (testmaterjal) adsorbeeritakse paneelide süvenditesse. Eespool märgiti, et antigeenide võime adsorbeeruda erinevat tüüpi plastidel on oluliselt erinev, olenevalt sellest, millisesse aineklassi (valgud, süsivesikud või lipoproteiinid) nad kuuluvad. Tihti on otseses ELISA-s tahkele faasile immobiliseeritud antigeeniks rakud ja muud osakeste antigeenid.

2. „Blokeerige tahkele faasile jäänud vabad sidumissaidid kaseiini BSA-ga jne (et vältida konjugaadi mittespetsiifilist sorptsiooni tahkel faasil).

3. Süvenditesse lisatakse ensüümiga märgistatud antikehad või antigeenid (konjugaat) ja inkubeeritakse. Konjugaadi seondumine tahke faasiga toimub ainult siis, kui süsteemi mõlemad komponendid on komplementaarsed. Pärast konjugaadiga inkubeerimist pestakse süvendid, eemaldades nii konjugaadi sidumata osa.

4. Seejärel lisatakse süvenditesse kasutatud ensüümile omane substraat ja inkubeeritakse. Kui positiivse kontrolli süvendites saavutatakse optimaalne värvumise tase, peatatakse ensüümi reaktsioon.

5. Reaktsiooni arvestamine. Esiteks võetakse reaktsiooni tulemusi visuaalselt arvesse. Tulemuste täpsemaks kajastamiseks hinnatakse värvimise intensiivsust ELISA lugejaga koos sobiva valgusfiltriga. Vastavalt analüüsi tulemustele joonistatakse graafik optilise tiheduse sõltuvusest kontsentratsioonist (joonis 2).

Joonis 2. Otsene ELISA.

a) antigeeni tuvastamiseks; b) antikehade tuvastamiseks.

Kaudne ELISA

Seda ELISA varianti kasutatakse tavaliselt spetsiifiliste antikehade tuvastamiseks. Standardantigeen adsorbeeritakse paneelide süvenditesse ja inkubeeritakse patsiendilt saadud seerumi või muu bioloogilise materjali proovidega (tserebrospinaalvedelik, sülg jne). Tahkel faasil oleva antigeeniga seotud spetsiifilised antikehad tuvastatakse antiglobuliini konjugaati kasutades. Sõltuvalt analüüsi eesmärgist kasutatakse erinevaid antiglobuliinireaktiive, mis tuvastavad kõigi isotüüpide või immunoglobuliinide üksikute klasside ja alamklasside spetsiifilisi antikehi. Meetodi peamine eelis on konjugaadi universaalsus. Sama konjugaati saab kasutada inimese antikehade tuvastamiseks paljude erinevate antigeenide suhtes mis tahes proovis. Reaktsioon on metoodiliselt lihtne.

Kaudse ELISA peamised etapid antikehade tuvastamiseks:

1. Antigeen adsorbeeritakse tahkele faasile, seejärel pestakse seondumata komponentidelt maha.

2. Blokeeri tasuta sidumissaidid. Pestud.

3. Uuritav materjal lisatakse süvenditesse, inkubeeritakse ja seejärel pestakse. Paralleelselt asetatakse positiivsete ja negatiivsete kontrollidega proovid.

4. Lisage antiglobuliini konjugaat töölahjenduses, inkubeerige, peske seondumata komponendid maha.

5. Substraat sisestatakse, inkubeeritakse. Kui positiivsetes kontrollisüvendites on saavutatud optimaalne värvumise tase, peatatakse reaktsioon stopplahuse lisamisega.

6. Mõõtke reaktsioonisaaduse kogus ELISA lugejal (joonis 3).

Optimaalsete analüüsitingimuste korral on meetod väga spetsiifiline ja tundlik. See võimaldab tuvastada uuritud patsientide seerumis nanogrammides antikehi. Rahuldavate tulemuste saamiseks on vajalik reaktiivide ja metoodikate standardimine. Seda ELISA varianti saab kasutada ka monoklonaalsete antikehade testimiseks.

"Sandwich" - ELISA variant antigeenide tuvastamiseks.

Selle ELISA variandiga tuvastatud antigeenidel peab olema mitu antikeha siduvat epitoopi või korduvad, ruumiliselt eraldatud epitoobid, millel on sama spetsiifilisus.

Selle ELISA variandi läbiviimisel inkubeeritakse uuritava prooviga tahkele faasile adsorbeeritud väga spetsiifilisi polü- või monoklonaalseid antikehi. Pärast pesemisprotseduuri lisatakse süvenditesse ensüümiga märgistatud antikehad (konjugaat) samale antigeenile ja seejärel viiakse läbi kõik muud reaktsiooni etapid. Spetsiifilise kompleksi moodustumise efektiivsus analüüsi igas etapis sõltub antigeeni-antikeha reaktsiooni seondumiskonstandist.

Analüüsi peamised etapid:

1. Monoklonaalsed antikehad või afiinsuspuhastatud polüklonaalsed antikehad immobiliseeritakse tahkele faasile.

2. Uuritav proov viiakse paneelide süvenditesse, positiivne kontrollproov ja negatiivne kontrollproov asetatakse paralleelselt erinevatesse lahjendustesse. Inkubeeritakse ja pestakse.

3. Süvenditesse sisestatakse ensüümiga märgistatud monoklonaalsed või polüklonaalsed antikehad (konjugaat). Pesemine toimub pärast inkubeerimist.

4. Substraat sisestatakse, inkubeeritakse. Reaktsioon peatatakse, kui positiivse kontrolli süvendites saavutatakse optimaalne värvumine.

5. Tulemuste arvestus ELISA lugejal.

Meetodi peamine eelis on selle kõrge tundlikkus, mis ületab teiste ELISA skeemide võimalused (joon. 4).

Joonis 3. Kaudne ELISA antikehade tuvastamiseks.

Konkurentsivõimeline ELISA.

See analüüsivõimalus põhineb märgistatud (konjugaat) ja märgistamata (test) antikehade konkureerimisel tahkel faasil adsorbeeritud antigeeniga seondumisel. Tahke faasi külge kinnitatud ensüümi hulk väheneb proportsionaalselt vabade antikehade sisaldusega segus. Antigeeni määramiseks kasutatakse sama võimalust, kuid sel juhul konkureerib soovitud antigeen märgistatud standardantigeeniga seondumisel tahke faasi pinnale immobiliseeritud antikehadega.

Võistlusmeetod nõuab minimaalset arvu toiminguid, vähest reaktiivide tarbimist ja seda on lihtne automatiseerida. Antikehade tuvastamiseks konkureeriva ELISA läbiviimisel on parem kasutada märgistatud monokliinseid antikehi, siis konjugaadi konkurents uuritava prooviga toimub tahkele faasile adsorbeeritud antigeeni ühe epitoobi suhtes. Seda ELISA varianti kasutatakse erinevate ühendite, näiteks inimese immunoglobuliinide, vähi-embrüonaalse antigeeni, insuliini jne määramiseks. See võimaldab tuvastada antikehi nakkusetekitajate diagnostiliselt oluliste epitoopide vastu.

Antigeeni tuvastamise analüüsi peamised etapid (joonis 5):

1. Detekteeritava antigeeni suhtes spetsiifilised monoklonaalsed antikehad immobiliseeritakse tahkele faasile.

2. Lisage paneelide süvenditesse ensüümiga märgistatud antigeen ja uuritav proov teadaolevas kontsentratsioonis. Viige läbi inkubeerimine ja pesemine. Paralleelselt asetatakse positiivsed ja negatiivsed kontrollid külgnevatesse süvenditesse. Kalibreerimise loomiseks, kasutades standardset märgistamata antigeeni erinevates lahjendustes.

3. Lisage substraat, inkubeerige, peatage reaktsioon, kui positiivse kontrolli süvendites tekib optimaalne värvumine.

4. ELISA lugeja reaktsiooni arvestamine.

Sel juhul on antigeeni kogus uuritavas proovis pöördvõrdeline tahke faasi ensümaatilise aktiivsusega.

inhibeeriv ELISA.

Selles ELISA variandis seostub uuritavas proovis olev antigeen ensüümiga märgistatud monoklonaalsete antikehadega ja inhibeerib nende interaktsiooni tahkele faasile immobiliseeritud standardantigeeniga. Konjugaadile spetsiifilise antigeeni isegi mikrokoguste olemasolu proovis pärsib märgistatud antikehade seondumist immobiliseeritud antigeeniga. Inhibeerimise aste on otseselt võrdeline antigeeni sisaldusega lahuses. Kvantitatiivseks analüüsiks koostatakse kalibreerimiskõver, kasutades standardantigeeni seerialahjendusi. Antigeeni tuvastamise inhibeeriva ELISA peamised etapid (joon. 6).

1. Adsorbeerige standardantigeen paneelide süvenditesse. Valige tiitrimise teel märgistatud antikehade töölahjendus.

Joonis 4. "Sandwich" - ELISA variant.

Joonis 5 Konkureeriv ELISA Joonis 6 Inhibeeriv ELISA

2. Konjugaati eelinkubeeritakse töölahjenduses uuritava proovi, standardantigeeni ja positiivse kontrollproovi lahjendustega.

3. Segu kantakse paneelide süvenditesse. 100% sidumise kontrollimiseks lisatakse mitmesse süvendisse ainult märgistatud antikehi, ilma inhibeeriva antigeenita. Paneele inkubeeritakse ja seejärel pestakse.

4. Lisa substraat.

5. Salvestage tulemused.

Määratava antigeeni kontsentratsioon uuritavas proovis on pöördvõrdeline tahke faasi ensümaatilise aktiivsusega.

ELISA abil saab määrata mitte ainult lahustuva antigeeni või antikeha, vaid ka erinevaid valke tootvaid rakke.

ELISA värvimismeetod ( ELISPOT).

1983. aastal kohandati ELISA tehnoloogiat lümfoidrakkude tuvastamiseks, mis sekreteerivad antikehi või antigeene (nt tsütokiine) in vitro. Meetodit nimetatakse ELISPOTiks (enzymatic immunoassay või spot method). Meetodi põhiprintsiip:

1. Polüstüreeni süvendi pinnale (kasutades 24 süvendiga rakukultuuri paneele) adsorbeeritakse antigeenid või antikehad, mis toimivad "püüdvate" reagentidena.

2. Lisatakse uuritud lümfoidrakud, kultiveeritakse mitu tundi 37°C juures, andes neile võimaluse hõivata teatud koht ja täita sekretoorset funktsiooni. Selliste rakkude poolt sekreteeritud antikehad või antigeenid püütakse kinni tahkele faasile adsorbeeritud reaktiividega.

3. Rakud eemaldatakse, kasutades rakke lüüsiva pesuvahendiga pesulahust.

4. Sekretoorsete saaduste kogunemiskohad näidatakse ensüümiga seotud antikehade lisamisega (antiglobuliini reaktiiv).

5. Lisatakse substraadi-agaroosi segu (kasutatud substraadid peaksid agaroosis lahustuma ja moodustama lahustumatud reaktsiooniproduktid), tahke faasi pinnale tekivad pruunid või sinised laigud (olenevalt kasutatavatest ensüümidest ja substraatidest), paljastades piirkonnad, kus rakud asuvad. asusid.

Saadud laigud loendatakse mikroskoobi all, see on sekreteerivate rakkude arv.

Tahke faasina saab kasutada nitrotselluloosmembraani Sel juhul on mitmeid eeliseid: tänu NCM-i suurele adsorptsioonivõimele on vaja oluliselt väiksemat kogust antigeeni, mida kasutatakse “püüdva” reagendina, lisaks agaroosi ei ole vaja substraadile lisada.

Määrates samaaegselt sekreteerivate rakkude arvu ja sekreteeritava antigeeni või antikeha koguhulga süvendis, mis on võimalik erineva substraadi kasutamisel, on võimalik määrata sekreteeritava aine kogust ühe raku järgi.

See meetod on leidnud laialdast rakendust adsorbeeritud antikehade poolt püütud antigeeni sekreteerivate rakkude arvu hindamiseks, seda kasutatakse tsütokiine (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a).

Signaali võimendussüsteemid.

Kõrge afiinsusega antikehade kasutamisel on üksikute ELISA variantide tundlikkus väga kõrge ja võimaldab teoreetiliselt tuvastada üksikuid antigeenimolekule, kuid praktikas piiravad tundlikkust mitmed tegurid: ensüümi aktiivsus, signaali intensiivsus ja signaali arvestusmeetodid. . Signaalivõimendussüsteemid võimaldavad tõsta erinevate ELISA variantide tundlikkust. Mõelge mõnele neist süsteemidest:

Põhineb avidiini ja biotiini koostoimel.

Biotiini koensüümi molekulid (m.m. 244 Da) konjugeeritakse antikehadega, kasutades biotinüül-N-hüdroksüsuktsimiidi. Väikest biotiini molekuli on lihtsam kinnitada immunoglobuliini või muu valgu külge, ilma et see rikuks selle immuun- või ensümaatilisi omadusi. Ensüüm on sel juhul seotud munavalge glükoproteiini avidiiniga. Avidiini seondumisafiinsus biotiini suhtes on väga kõrge (kompleksi dissotsiatsioonikonstant on 10-15 mol), avidiini-ensüümi konjugaat on kindlalt fikseeritud antigeen-antikeha-biotiini kompleksil. Pärast sobiva substraadi lisamist määratakse reaktsiooniprodukt spektrofotomeetriliselt või luminestsentsi intensiivsuse järgi.

Üks avidiini molekul koosneb neljast identsest subühikust, on võimeline interakteeruma nelja biotiini molekuliga, mis võimaldab seda kasutada kahe biotiini sisaldava ühendi ühendava molekulina. Sel juhul biotinüleeritakse ka ensüüm ja avidiin toimib sillana, ühendades kaks biotiinijääke sisaldavat molekuli. Saadud antigeen-antikeha-biotiini kompleksile lisatakse vaba avidiin, millele järgneb biotinüülitud ensüüm. Salvestage reaktsioon.

Avidiini valku saab mittespetsiifiliselt sorbeerida teistele molekulidele; seetõttu kasutatakse üha enam teist biotiini siduvat valku, streptavidiini, mida leidub bakteris Streptomyces avidinii. Streptavidiin moodustab ka biotiiniga tugeva kompleksi ja koosneb neljast identsest subühikust.

Avidiini-biotiini kompleksi kasutamine võimaldab oluliselt tõsta ELISA tundlikkust, kuna konjugaadi sünteesi käigus võib ühe AT molekuliga seonduda kümneid biotiini molekule. Konjugaatide (antikehad ja ensüümid biotiiniga) saamine on üsna lihtne ning sellega kaasnevad minimaalsed muutused nende immunoloogilises ja ensümaatilises aktiivsuses. Ensüümide konjugaate biotiiniga saab kasutada universaalsete reagentidena.

Kemoluminestsentsreaktsioonide kasutamine.

Kemiluminestsentsreaktsioone saab kasutada signaali saamiseks ELISA-s, suurendades samal ajal meetodi tundlikkust ja vähendades analüüsi aega. Mädarõika peroksüdaasi kasutatakse ELISA-s laialdaselt märgisena, selle tuvastamiseks saab kasutada ka erinevaid kemoluminestsentsreaktsioone. Kemiluminestsentsreaktsioonid põhinevad luminooli võimel vesinikperoksiidiga oksüdeerimisel hõõguda. Otseses analüüsis tekitab ensümaatiline reaktsioon vesinikperoksiidi ja oksüdeerib luminooli; seda reaktsiooni katalüüsib mädarõika peroksidaas. Signaali võimendamiseks kasutatakse erinevaid ühendeid, näiteks lutsiferiini, fenoole, sel juhul suurendatakse luminestsentsi intensiivsust 10-100 korda, mõnel juhul 500 korda (võimendatud kemoluminestsentsanalüüs). Luminestsentssignaal on väga stabiilne, selle tase saavutab maksimumi 30 sekundiga (võrdluseks: värvireaktsioon OPD-ga kui indikaatoriga areneb täielikult välja alles 30 minutiga).

Kaudsel analüüsil luminooli või selle derivaatidega antikeha märgistatakse. Sellist vabas olekus olevat märgist on võimalik valguse vabanemisega vesinikperoksiidiga oksüdeerida. Kui see on moodustanud kompleksi, kaotab see oksüdeerumisvõime.

Põhineb kaskaadsüsteemidel.

ELISA tundlikkuse suurendamiseks võib kasutada ensüümikaskaadsüsteeme. Sel juhul annab esimene antikehaga seotud ensüüm teise ensüümsüsteemi jaoks redutseeritava substraadi. Teine ensüümsüsteem võib olla substraattsükliline või redoksütsükliline. Ensümaatilised märgised võivad sel juhul olla fosfoglükoisomeraas, aldolaas, aluseline fosfataas. Reaktsiooni lõppsaadus määratakse visuaalselt või spektrofotomeetriliselt.

ELISA võimendussüsteemid saavutavad kõrge tundlikkuse. Selliseid ELISA süsteeme kasutatakse hormoonide taseme määramiseks (kilpnääret stimuleeriv, progesteroon jne).

ELISA praktiline rakendamine.

ELISA on leidnud laialdast rakendust erinevates meditsiini ja bioloogia valdkondades tänu meetodi suhtelisele lihtsusele ja kõrgele tundlikkusele. ELISA-t on edukalt kasutatud:

Hormoonide ja ravimite taseme tuvastamine ja määramine bioloogilistes proovides;

Spetsiifilise antigeeni vastaste antikehade isotüübi määramine (IgG, IgM ja teised);

Immuunkomplekside tuvastamine;

Kasvaja markerite tuvastamine;

Vere seerumi valkude (ferritiin, fibronektiin jne) määramine;

Üldine IgE ja spetsiifiliste IgE antikehade määramine;

Müoklonaalsete antikehade sõeluuring;

Tsütokiinide määratlused bioloogilistes vedelikes.

Meetodi tundlikkus

ELISA on asendanud varem kliinilises praktikas laialdaselt kasutatud aglutinatsiooni, sadestamise ja RIA meetodid. Võrreldes ülaltoodud meetoditega on ELISA vähem töömahukas ja vähem aeganõudev ning mugav suure hulga sama tüüpi analüüside tegemiseks.

ELISA ühendab immunokeemilise analüüsi ainulaadse spetsiifilisuse ensüümi märgistamise kõrge tundlikkusega. Meetodi tundlikkus (tundlikkuse all tähendab minimaalset tuvastatavat antikehade või antigeeni kogust) määratakse järgmiste teguritega: antikehade afiinsus, eelistatav on monoklonaalsete antikehade kasutamine; ensüümi spetsiifiline aktiivsus; signaali intensiivsus; signaali tundlikkus. Erinevad ELISA variandid erinevad oma tundlikkuse poolest. Tahkefaasi ELISA eraldi variandid võimaldavad tuvastada proovis üksikuid molekule. ELISA keskmine tundlikkus on 10 -9 - 10 -12 mol.

Bibliograafia.

1. Galaktionov V.G. Immunoloogia. Moskva ülikooli kirjastus, 1998
2. Kishkun A.A. Immunoloogilised uuringud ja nakkushaiguste diagnoosimise meetodid kliinilises praktikas. Meditsiiniuudiste agentuur, 2009
Süüfilise diagnoosimiseks võib kasutada muid meetodeid: ensüümi immuunanalüüs (ELISA) reaktsiooniga ...

Ensüümi immuunanalüüsi põhimõtted, ELISA peamised tüübid, rakendamine diagnostikas

Samoilikov Pavel Vladimirovitš Kliinilise laboratoorse diagnostika osakonna praktikant

Venemaa Riiklik Meditsiiniülikool

Sissejuhatus.

Immunoanalüüsi meetodeid on meditsiinipraktikas laialdaselt kasutatud. Kõigis kaasaegse meditsiini valdkondades kasutatakse immuunanalüüsi, peamiselt diagnostilistel ja analüütilistel eesmärkidel. Eriti oluline on, et need võimaldaksid tuvastada bioloogilisi komponente (hormoonid, ensüümid, neuropeptiidid, immuunsüsteemi tooted, antigeenid jne) madalal ja väga madalal kontsentratsioonil. Nende meetoditega tuvastatakse kõik tooted, mille vastu on võimalik antikehi saada.

Immuunanalüüs põhineb antigeeni (AG) ja antikeha (AT) interaktsioonil, kasutades ühe komponendi (ensüüm, radionukliid, fluorestsentsvärv ja teised) erinevaid märgistamisvõimalusi. Reaktsiooni hindamine toimub automaatselt spetsiaalse seadmega, mis võimaldab neid meetodeid standardida.

Sõltuvalt kasutatava märgise tüübist ja testi seadistamise tingimustest nimetatakse immuunanalüüsi ensüümi immuunanalüüsiks (ELISA), radioimmunoanalüüsiks (RIA), immunofluorestsentsanalüüsiks ja teisteks. Kui reaktsioonid on lavastatud ühes või mitmes etapis, nimetatakse neid otsesteks või kaudseteks. Oluline on keskkond, milles reaktsioon läbi viiakse. Kui reaktsioon viiakse läbi pinnale fikseeritud reagentidega, nimetatakse katset tahkefaasiliseks testiks, näiteks ELISA (ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs).

Selles artiklis käsitletakse ainult ensüümi immuunanalüüsi - meetodit, mida kasutatakse laialdaselt bioloogias ja meditsiinis, nii praktilises kui ka fundamentaalses mõttes.

Seotud immunosorbentanalüüs.

ELISA ilmus 60. aastate keskel ja töötati algselt välja meetodina antigeeni tuvastamiseks histoloogilises preparaadis, samuti sademete joonte visualiseerimiseks immunodifusioonitestis ja immunoelektroforeesis ning seejärel hakati seda kasutama antigeenide ja antigeenide kvantitatiivseks määramiseks. antikehad bioloogilistes vedelikes. Meetodi väljatöötamises osalesid E. Engvall ja R. Pelman, samuti neist sõltumatult W. Van Veeman ja R. Schurs.

Joonis 1. ELISA põhiprintsiip.

1) Antigeenide tuvastamiseks. 2) Antikehade tuvastamiseks.

Meetod põhineb antikeha spetsiifilisel seondumisel antigeeniga, kusjuures üks komponentidest on konjugeeritud ensüümiga, reaktsiooni tulemusena vastava kromogeense substraadiga moodustub värviline saadus, mille kogust saab määratakse spektrofotomeetriliselt (joonis 1).

Antigeenide ja antikehade immobiliseerimise võimaluse avastamine erinevatel kandjatel, säilitades samal ajal nende seondumisaktiivsuse, on võimaldanud ELISA kasutamist laiendada erinevates bioloogia ja meditsiini valdkondades.

Monoklonaalsete antikehade ilmumine oli ELISA edasiarendus, mis võimaldas suurendada selle tundlikkust, spetsiifilisust ja tulemuste reprodutseeritavust.

Teoreetiliselt põhineb ELISA kaasaegse immunokeemia ja keemilise ensümoloogia andmetel, antigeeni-antikeha reaktsiooni füüsikalis-keemiliste seaduspärasuste tundmisel, aga ka analüütilise keemia põhiprintsiipidel. ELISA tundlikkuse ja selle kestuse määravad mitmed peamised tegurid: antigeeni-antikeha reaktsiooni kineetilised ja termodünaamilised omadused, reaktiivide suhe, ensüümi aktiivsus ja selle tuvastamismeetodite lahutusvõime. Üldiselt saab antigeen-antikeha reaktsiooni kirjeldada lihtsa skeemi abil:

+[AG]↔[ATAG]

Uurimisobjektide mitmekesisus alates madala molekulmassiga ühenditest kuni viiruste ja bakteriteni, samuti ebatavaliselt suur hulk ülesandeid, mis on seotud ELISA kasutamise erinevate tingimustega, määravad selle meetodi äärmiselt suure hulga variantide väljatöötamise. .

Iga ELISA variant sisaldab 3 kohustuslikku etappi:

1. uuritava ühendi äratundmise staadium sellele spetsiifilise antikeha poolt, mis viib immuunkompleksi moodustumiseni;

2. konjugaadi seose moodustumise staadium immuunkompleksi või vabade sidumissaitidega;

3. ensüümi märgise registreeritud signaaliks muutmise etapp.

ELISA klassifikatsioon.

ELISA meetodite klassifikatsioon põhineb mitmel lähenemisviisil:

1. ELISA esimeses etapis esinevate reaktiivide tüübi järgi eristatakse konkureerivaid ja mittekonkureerivaid meetodeid.

A) Konkureerivas ELISA-s sisaldab süsteem esimeses etapis nii analüüsitavat ühendit kui ka selle analoogi, mis on märgistatud ensüümiga ja konkureerib sellega spetsiifiliste seondumiskohtade pärast.

B) Mittekonkureerivate meetodite puhul on süsteemis esimeses etapis iseloomulik ainult analüüsitava ühendi ja sellele spetsiifiliste sidumiskeskuste olemasolu.

2. Kõik ELISA meetodid jagunevad homogeenseteks ja heterogeenseteks.

Kui ELISA kõik kolm etappi viiakse läbi lahuses ja põhietappide vahel puuduvad täiendavad moodustunud immuunkomplekside eraldamise etapid reageerimata komponentidest, kuulub meetod homogeensete hulka.

Homogeense ELISA, mida tavaliselt kasutatakse madala molekulmassiga ainete määramiseks, aluseks on ensüümi aktiivsuse pärssimine, kui see kombineeritakse antigeeni või antikehaga. Ensüümi aktiivsus taastub antigeen-antikeha reaktsiooni tulemusena.

Kui antikeha seondub ensüümi märgist sisaldava antigeeniga, inhibeeritakse ensüümi aktiivsust 95% kõrge molekulmassiga substraadi suhtes, mis on tingitud substraadi steerilisest välistamisest ensüümi aktiivsest keskusest. Antigeeni kontsentratsiooni suurenedes seondub rohkem antikehi ja säilib rohkem vabu antigeen-ensüümi konjugaate, mis suudavad hüdrolüüsida suure molekulmassiga substraati. Analüüs tehakse väga kiiresti, ühe määramise jaoks kulub 1 minut. Meetodi tundlikkus on üsna kõrge. Selle abil saate aine määrata pikomoolide tasemel.

Heterogeensete meetodite puhul on tüüpiline analüüs läbi viia kahefaasilises süsteemis, milles osaleb tahke faas - kandja ja immuunkomplekside eri faasides (moodustunud) reageerimata komponentidest eraldamise kohustuslik etapp (pesemine). immuunkompleksid on tahkel faasil ja reageerimata kompleksid on lahuses). Heterogeenseid meetodeid, mille puhul immuunkomplekside moodustumine esimeses etapis toimub tahke faasi alusel, nimetatakse tahkefaasi meetoditeks.

Meetodid klassifitseeritakse homogeenseteks-heterogeenseteks, kui 1. etapp - spetsiifiliste komplekside moodustumine toimub lahuses ja seejärel kasutatakse komponentide eraldamiseks tahket faasi immobiliseeritud reagendiga.

3. Vastavalt uuritava aine määramise põhimõttele:

A) Aine (antigeeni või antikeha) kontsentratsiooni otsene määramine sellega interakteeruvate sidumiskeskuste arvu järgi. Sel juhul on ensüümi märgis saadud spetsiifilises AG-AT kompleksis. Analüüdi kontsentratsioon on otseselt võrdeline registreeritud signaaliga.

B) Aine kontsentratsiooni määramine sidumissaitide koguarvu ja järelejäänud vabade seondumiskohtade erinevuse järgi. Sel juhul suureneb analüüdi kontsentratsioon ja salvestatud signaal väheneb, seega on sel juhul pöördvõrdeline sõltuvus salvestatud signaali suurusest.

ELISA-s kasutatud komponentide omadused.

Ensüümid.

Ensüümimärgistel on äärmiselt võimas katalüütiline toime, üks ensüümi molekul võib reageerida suure hulga substraadimolekulidega. Seega saab tühistes kogustes esinevat ensüümi tuvastada ja kvantifitseerida saaduste moodustumise ehk reaktsiooni kaudu, mida see katalüüsib. Ensüümide märgistusena kasutamise eeliseks on ka arvukate funktsionaalrühmade (sulfhüdrüül-, karboksüül-, türasiinijäägid jne) olemasolu molekulis, mille kaudu saab ligandimolekule kovalentselt siduda.

ELISA-s kasutatavatel ensümaatilistel markeritel peaksid olema järgmised omadused:

– ensüümi kõrge aktiivsus ja stabiilsus analüüsitingimustes, modifitseerimise ajal ja konjugatsioonis antikehade või muude valkudega;

– tundlike substraatide olemasolu ja ensümaatilise reaktsiooni produktide või substraatide määramise meetodi lihtsus;

– substraadisüsteemide kohandamise võimalus edasiseks tugevdamiseks;

- ensüümi ja selle inhibiitorite puudumine uuritavas bioloogilises vedelikus.

ELISA abil saab kasutada vähemalt 15 erinevat ensüümi. Ülaltoodud nõuete kohaselt on suurimaks kasutuseks mädarõika peroksidaas (HRP), aluseline fosfataas (AP) ja β-D-galaktosidaas (tabel 1). Kõik kolm on stabiilsed ja katalüüsivad väga tundlikke reaktsioone. Lisaks saab nende ensüümide poolt katalüüsitavate reaktsioonide saadusi olenevalt kasutatavast substraadist tuvastada mitte ainult kolorimeetriliste meetoditega, vaid ka fluorestsentsmeetoditega. Teisi ensüüme kasutatakse palju harvemini. See on seletatav nende madalama spetsiifilise aktiivsusega võrreldes HRP ja AP-ga.

Substraadid.

Substraadi valiku määrab eelkõige märgisena kasutatav ensüüm, kuna ensüümi-substraadi reaktsioon on väga spetsiifiline.

Põhinõuded aluspinnale:

– meetodi kõrge tundlikkuse tagamine ensüümi tuvastamisel konjugaadis;

– ensüüm-substraadi reaktsiooni täpselt määratletud (näiteks värviliste) produktide moodustumine;

– aluspind peab olema ohutu, odav, ligipääsetav ja mugav kasutada.

Tabel 1.

Ensüüme ja nende substraate kasutatakse ELISA-s enim.

Frement	Kviitungi allikas	MM. (kDa)	Substraat (soovitatav lainepikkus fotomeetria jaoks, nm)	Konjugeeriv reaktiiv
mädarõika peroksidaas	Mädarõigas (Armoracia rusticana)	40	O-fenüleendiamiindivesinikkloriid (OPD, 492 nm) 5-aminosalitsüülhape (450 nm), diaminobensidiin, o-dianisidiin.	Glutaraldehüüd Meta-perjodaadi naatrium N-suktsiinimidüül-3 (2-püridüülditio)propionaat
β-D-galaktosidaas	E. coli	540	O-nitrofenüül-β-D-galaktosiid (420 nm)	Meta-maleimidobenseen-N-hüdroksüsuktsiinimiidi ester
Leeliseline fosfataas	E. coli, vasika soole limaskest	84-150	P-nitrofenüülfosfaat (405 nm), 5-bromo-4-kloro-3-indolüülfosfaat	Glutaraldehüüd

Sagedamini kasutatakse kromogeenseid substraate, mis hävitamisel moodustavad värvilise aine. Paljutõotav on kõrge energiaga substraatide kasutamine - fluorestseeruvad, kemoluminestsents. Selliste substraatide kasutamine võimaldab teoreetiliselt tõsta ELISA tundlikkust kahe suurusjärgu võrra.

Antigeenid ja antikehad.

ELISA-s kasutatavad AG ja AT peaksid olema kõrgelt puhastatud ja väga aktiivsed. Lisaks peaks AG-l olema kõrge antigeensus, optimaalne tihedus ja antigeensete determinantide arv, võõras ja homogeensus. Paljud sünteetilised ja rekombinantsed viiruste ja bakterite antigeenid on end ELISA-s kasutades hästi tõestanud. See suurendas oluliselt meetodi spetsiifilisust ja reprodutseeritavust, minimeerides ristreaktsioone.

ELISA üks olulisemaid reaktiive on antikehad. ELISA tundlikkus sõltub kasutatavate antikehade kontsentratsioonist, aktiivsusest ja spetsiifilisusest. Kasutatavad antikehad võivad olla polü- või monokliinsed, erineva klassi (IgG või IgM) ja alamklassiga (IgGl, IgG2), anti-allotüüpsed või anti-idiotüüpsed. Madala AT afiinsuse korral viib AG-AT kompleksi lagunemine seotud AG eemaldamiseni süsteemist. Meetodi tundlikkust ja spetsiifilisust suurendab monoklonaalsete antikehade kasutamine. Sel juhul on võimalik tuvastada uuritavates proovides AG (AT) madalaid kontsentratsioone.

Konjugaadi moodustumine

Konjugaat on ensüümmärgisega märgistatud antigeen või antikeha. Konjugaadi moodustamine on ELISA üks olulisi etappe.

Konjugaadi moodustamisel valitakse selline optimaalne meetod ensüümi märgistuse sisestamiseks nii, et konjugaadi mõlemad komponendid säilitaksid oma bioloogilise aktiivsuse: ensüüm - võime suhelda substraadiga ja antigeen või antikeha - antigeensus ja antigeeniga seondumine. tegevust vastavalt. Märgistatud kõrgelt puhastatud antigeeni olemasolu võimaldab kasutada konkureerivaid meetodeid. Sel juhul saab lõppfaasis mõõta immobiliseeritud antikehadega seondumata konjugaadi aktiivsust, mis väldib pesemisprotseduuri ja muudab analüüsi mugavamaks. Antigeenid on aga oma füüsikalis-keemiliste omaduste ja struktuuri poolest mitmekesised, mistõttu on võimatu välja töötada universaalseid meetodeid antigeeniga konjugaadi saamiseks. Sel juhul on antigeen-ensüümi konjugaadi saamine eraldi väljakutse. Märgistatud antikehade valmistamine ELISA jaoks on metoodiliselt paremini kättesaadav.

Ensüümi konjugeerimine immunokeemiliselt aktiivsete valkudega toimub erinevate meetoditega: keemiline ristsidumine, ensüümi molekuli kovalentne sidumine AG või AT-ga ja ühendite moodustumine mittekovalentsete sidemete kaudu, näiteks siis, kui ensüüm ja AG või AT viiakse läbi immunoloogiliselt antigeeni-antikeha interaktsiooni kaudu.

Kõige laialdasemalt kasutatavad kovalentsed meetodid konjugaatide valmistamiseks. Sidumisreaktsiooni valiku määrab nendes valgusmolekulides saadaolevate funktsionaalrühmade tüüp. Glutaraldehüüdi, naatriumperjodaati jne kasutatakse reagentidena, mida kasutatakse ensüümi viimiseks antigeeni- ja antikehamolekulidesse.

Konjugaatide saamiseks glutaaraldehüüdi abil on olemas ühe- ja kaheetapilised meetodid. Võib moodustada erineva suurusega konjugaate, millel on vähenenud ensümaatiline aktiivsus (15–60% vabast ensüümist). Saadud suuremõõtmeline konjugaat võib steeriliselt takistada uuritava aine määramist. Suhteliselt madala molekulmassiga konjugaadid koosnevad Fab fragmendist ja ühest ensüümi molekulist.

Kaheetapilise sünteesi tulemusena, mis seisneb esmalt ristsiduva ainega modifitseeritud ensüümi etapiviisilises valmistamises, selle eraldamises ja seejärel selle järgnevas interaktsioonis antigeeniga (antikehaga), moodustuvad ensüümi molekulid. moodustuvad homogeensed koostised, mis sisaldavad 1-2 ensüümi molekuli immunoglobuliini molekuli kohta ning säilitavad kõrge ensümaatilise ja immunoloogilise aktiivsuse. Selliste konjugaatide hulk on aga väike (mädarõika peroksidaasi puhul 5–10%).

Suurima praktilise rakenduse on leidnud immunoperoksidaasi konjugaatide saamise meetod, mis põhineb ensüümi süsivesikute komponendi oksüdeerimisel naatriumperjodaadiga (peroksidaasi seondumine konjugaadiga ulatub 70-90% ensüümi esialgsest kogusest).

Usaldusväärsel konjugaadil peavad olema järgmised omadused:

Kõrge antikehade tiiger ja kõrge afiinsus antigeeni suhtes, nii et seda saab kasutada suures lahjenduses ja seega vähendada mittespetsiifilist seondumist;

Piisav spetsiifilisus tööaretuses;

Monomeersete vormide ülekaal polümeersete üle, sest polümeersed vormid kipuvad plastiga mittespetsiifiliselt kleepuma, mille tulemuseks on reaktsiooni kõrge tausttase;

Optimaalne molaarsuhe ensüümi ja antikehade vahel (optimaalne suhe on umbes 1:1);

Konjugaadi piisav ensümaatiline aktiivsus. Selle omaduse määravad peamiselt konjugatsiooni tingimused ning ensüümi ja antikeha molekulide suhe konjugaadis.

tahke faas

ELISA jaoks võib tahke faasina kasutada erinevaid materjale: polüstüreeni, polüvinüülkloriidi, polüpropüleeni ja muid aineid. Tahkeks faasiks võivad olla katseklaasi seinad, 96 süvendiga ja muud plaadid, pallid, helmed, aga ka nitrotselluloos ja muud membraanid, mis aktiivselt valke absorbeerivad.

Antigeeni või antikehade immobiliseerimine tahkel faasil on võimalik kolmel viisil:

– passiivne adsorptsioon, mis põhineb tugevatel hüdrofoobsetel interaktsioonidel valkude ja sünteetilise pinna vahel;

– kovalentne kinnitumine tahke faasi külge;

– immunokeemiline jne (mittekovalentne ja mitteadsorptsioonkinnitus).

Valkude passiivset adsorptsiooni kasutatakse laialdaselt ELISA läbiviimisel tiitrimisplaatidel, nitrotselluloosmembraanidel. Passiivne adsorptsioon järgib küllastuse põhimõtet ja korreleerub adsorbeeritud aine molekulmassiga. Erinevat tüüpi membraanide (nitrotselluloos, nailon jne) adsorptsioonipind on 100-1000 korda kõrgem kui plastil.

Polüsahhariididel ja kõrgelt glükosüülitud valkudel on sageli madal afiinsus polüstüreeni suhtes. Nende immobiliseerimiseks on vaja muid meetodeid, näiteks kovalentset kinnitamist glutaaraldehüüdiga. Kovalentne kinnitus on efektiivne, kui tahke faasina kasutatakse hüdrofiilseid helmeid (agaroos) ja polüstüreenhelmeid.

Immunokeemilised meetodid põhinevad eelnevalt adsorbeeritud "lõksu" antikehade kasutamisel antigeeni või antikehade immobiliseerimiseks. Immunokeemiliselt immobiliseeritud antigeen on 10 korda aktiivsem kui passiivselt adsorbeeritud antigeen. Võib kasutada lektiine või bakterite immunoglobuliini siduvaid valke, mis on kergesti adsorbeeruvad plastile või muudele hüdrofoobsetele pindadele, nagu konkanavaliin A (Con A) või stafülokoki valk A. Con A on võimeline immobiliseerima HIV viiruse gp 120 valku.

Tahke faasi pinnal olevad vabad kohad, mis ei ole sorbeeritud ainega seondunud, võivad testi käigus fikseerida teisi molekule, sealhulgas konjugaate, mis viib taustsignaali suurenemiseni. Et vältida mittespetsiifilist seondumist pärast immobiliseerimist alusmaterjali tahkele faasile, töödeldakse ainetega, mis on testi jaoks neutraalsed. Kõige populaarsemad blokeerivad ained on veise seerumi albumiin (BSA), kaseiin jne. Blokeeriva aine valik ja selle etapi tingimused sõltuvad tahke faasi tüübist ja süsteemi tundlikkusest.

ELISA lavastusvõimalused.

Üldine põhimõte.

Praegu kasutatakse tohutul hulgal erinevaid ELISA sorte ja modifikatsioone. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) erinevad variandid on laialt levinud.

Tahkefaasiline ELISA pakuti välja 1971. aastal. Tahkefaasilise ELISA põhiprintsiibid, olenemata modifikatsioonist, on järgmised:

Kell krooniline vorm protsess, sest äge vorm seda protseduuri võib kaasa aidata nakkuse levikule katvatesse osakondadesse Urogenitaalsüsteem. Laboratoorse diagnostika meetodid gonokoki infektsioon: · mikroskoopiline (bakterioskoopiline), · kultuuriline (bakterioloogiline). Molekulaarbioloogiline. 2.3.1 Mikroskoopilised uurimismeetodid Kui...

Unustatakse, et aflatoksiinide ja muude toksiinide määramisele peab eelnema nende eraldamine ekstraheerimise teel. See nõue kehtib nii immuunanalüüsi kui ka klassikalisemate analüütiliste meetodite puhul, nagu õhukese kihi kromatograafia ja kõrgsurvevedelikkromatograafia. Vajadus analüüdi ekstraheerimise järele raskendab sobiva ...

Ja keha koostoime patogeeniga vastava nakkushaigus. Lisaks mitmed sarnased haigused kliiniline pilt(nt riketsioos, enteroviiruse infektsioonid) saab eristada ainult seroloogiliselt, mis peegeldab seroloogiliste meetodite tähtsust nakkushaiguste diagnoosimisel. 3.6 Seroloogilised reaktsioonid Seroloogilised reaktsioonid on tähistatud ...

HIV-nakkust ja AIDS-i saab tuvastada ainult patogeeni enda tuvastamisel patsiendi kehas. Seda on aga üsna raske teha. Levinud meetod AIDS-i diagnoosimiseks põhineb spetsiifiliste viirusevastaste antikehade tuvastamisel erinevate immunoloogiliste reaktsioonide abil (ensüümimmunoanalüüs, fluorestseeruvate antikehade meetod, lateksi aglutinatsiooni test, immunoblotanalüüs). ...

Kui palju paberi kirjutamine maksab?

Valige töö tüüp Lõputöö(bakalaureus/spetsialist) Lõputöö osa Magistridiplom Kursusetöö praktikaga Kursuse teooria Essee Essee Eksamiülesanded Atesteerimistööd (VAR/VKR) Äriplaan Eksami küsimused MBA diplomitöö (kõrgkool/tehnikum) Muud juhtumid Laboratoorsed tööd, RGR On- Veebiabi Praktikaaruanne Teabe leidmine PowerPointi esitlus Kraadiõppe essee Diplom Kaasnevad materjalid Artikkel Testi joonised veel »

Täname, teile on saadetud e-kiri. Kontrolli oma e-posti.

Kas soovite 15% allahindlust sooduskoodi?

Saate SMS-i
koos sooduskoodiga

Edukalt!

?Öelge juhiga vestluse ajal sooduskood.
Sooduskoodi saab esimesel tellimusel kasutada ainult üks kord.
Sooduskoodi tüüp – " lõputöö".

Ensüümi immuunanalüüsi põhimõtted, ELISA peamised tüübid, rakendamine diagnostikas

Ensüümi immuunanalüüsi põhimõtted, ELISA peamised tüübid, rakendamine diagnostikas

Samoilikov Pavel Vladimirovitš Kliinilise laboratoorse diagnostika osakonna praktikant

Venemaa Riiklik Meditsiiniülikool

Sissejuhatus.

Immunoanalüüsi meetodeid on meditsiinipraktikas laialdaselt kasutatud. Kõigis kaasaegse meditsiini valdkondades kasutatakse immuunanalüüsi, peamiselt diagnostilistel ja analüütilistel eesmärkidel. Eriti oluline on, et need võimaldaksid tuvastada bioloogilisi komponente (hormoonid, ensüümid, neuropeptiidid, immuunsüsteemi tooted, antigeenid jne) madalal ja väga madalal kontsentratsioonil. Nende meetoditega tuvastatakse kõik tooted, mille vastu on võimalik antikehi saada.

Immuunanalüüs põhineb antigeeni (AG) ja antikeha (AT) interaktsioonil, kasutades ühe komponendi (ensüüm, radionukliid, fluorestsentsvärv ja teised) erinevaid märgistamisvõimalusi. Reaktsiooni hindamine toimub automaatselt spetsiaalse seadmega, mis võimaldab neid meetodeid standardida.

Sõltuvalt kasutatava märgise tüübist ja testi seadistamise tingimustest nimetatakse immuunanalüüsi ensüümi immuunanalüüsiks (ELISA), radioimmunoanalüüsiks (RIA), immunofluorestsentsanalüüsiks ja teisteks. Kui reaktsioonid on lavastatud ühes või mitmes etapis, nimetatakse neid otsesteks või kaudseteks. Oluline on keskkond, milles reaktsioon läbi viiakse. Kui reaktsioon viiakse läbi pinnale fikseeritud reagentidega, nimetatakse katset tahkefaasiliseks testiks, näiteks ELISA (ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs).

Selles artiklis käsitletakse ainult ensüümi immuunanalüüsi - meetodit, mida kasutatakse laialdaselt bioloogias ja meditsiinis, nii praktilises kui ka fundamentaalses mõttes.

Seotud immunosorbentanalüüs.

ELISA ilmus 60. aastate keskel ja töötati algselt välja meetodina antigeeni tuvastamiseks histoloogilises preparaadis, samuti sademete joonte visualiseerimiseks immunodifusioonitestis ja immunoelektroforeesis ning seejärel hakati seda kasutama antigeenide ja antigeenide kvantitatiivseks määramiseks. antikehad bioloogilistes vedelikes. Meetodi väljatöötamises osalesid E. Engvall ja R. Pelman, samuti neist sõltumatult W. Van Veeman ja R. Schurs.

Joonis 1. ELISA põhiprintsiip.

1) Antigeenide tuvastamiseks. 2) Antikehade tuvastamiseks.

Meetod põhineb antikeha spetsiifilisel seondumisel antigeeniga, kusjuures üks komponentidest on konjugeeritud ensüümiga, reaktsiooni tulemusena vastava kromogeense substraadiga moodustub värviline saadus, mille kogust saab määratakse spektrofotomeetriliselt (joonis 1).

Antigeenide ja antikehade immobiliseerimise võimaluse avastamine erinevatel kandjatel, säilitades samal ajal nende seondumisaktiivsuse, on võimaldanud ELISA kasutamist laiendada erinevates bioloogia ja meditsiini valdkondades.

Monoklonaalsete antikehade ilmumine oli ELISA edasiarendus, mis võimaldas suurendada selle tundlikkust, spetsiifilisust ja tulemuste reprodutseeritavust.

Teoreetiliselt põhineb ELISA kaasaegse immunokeemia ja keemilise ensümoloogia andmetel, antigeeni-antikeha reaktsiooni füüsikalis-keemiliste seaduspärasuste tundmisel, aga ka analüütilise keemia põhiprintsiipidel. ELISA tundlikkuse ja selle kestuse määravad mitmed peamised tegurid: antigeeni-antikeha reaktsiooni kineetilised ja termodünaamilised omadused, reaktiivide suhe, ensüümi aktiivsus ja selle tuvastamismeetodite lahutusvõime. Üldiselt saab antigeen-antikeha reaktsiooni kirjeldada lihtsa skeemi abil:

+[AG]↔[ATAG]

Uurimisobjektide mitmekesisus alates madala molekulmassiga ühenditest kuni viiruste ja bakteriteni, samuti ebatavaliselt suur hulk ülesandeid, mis on seotud ELISA kasutamise erinevate tingimustega, määravad selle meetodi äärmiselt suure hulga variantide väljatöötamise. .

Iga ELISA variant sisaldab 3 kohustuslikku etappi:

1. uuritava ühendi äratundmise staadium sellele spetsiifilise antikeha poolt, mis viib immuunkompleksi moodustumiseni;

2. konjugaadi seose moodustumise staadium immuunkompleksi või vabade sidumissaitidega;

3. ensüümi märgise registreeritud signaaliks muutmise etapp.

ELISA klassifikatsioon.

ELISA meetodite klassifikatsioon põhineb mitmel lähenemisviisil:

1. ELISA esimeses etapis esinevate reaktiivide tüübi järgi eristatakse konkureerivaid ja mittekonkureerivaid meetodeid.

A) Konkureerivas ELISA-s sisaldab süsteem esimeses etapis nii analüüsitavat ühendit kui ka selle analoogi, mis on märgistatud ensüümiga ja konkureerib sellega spetsiifiliste seondumiskohtade pärast.

B) Mittekonkureerivate meetodite puhul on süsteemis esimeses etapis iseloomulik ainult analüüsitava ühendi ja sellele spetsiifiliste sidumiskeskuste olemasolu.

2. Kõik ELISA meetodid jagunevad homogeenseteks ja heterogeenseteks.

Kui ELISA kõik kolm etappi viiakse läbi lahuses ja põhietappide vahel puuduvad täiendavad moodustunud immuunkomplekside eraldamise etapid reageerimata komponentidest, kuulub meetod homogeensete hulka.

Homogeense ELISA, mida tavaliselt kasutatakse madala molekulmassiga ainete määramiseks, aluseks on ensüümi aktiivsuse pärssimine, kui see kombineeritakse antigeeni või antikehaga. Ensüümi aktiivsus taastub antigeen-antikeha reaktsiooni tulemusena.

Kui antikeha seondub ensüümi märgist sisaldava antigeeniga, inhibeeritakse ensüümi aktiivsust 95% kõrge molekulmassiga substraadi suhtes, mis on tingitud substraadi steerilisest välistamisest ensüümi aktiivsest keskusest. Antigeeni kontsentratsiooni suurenedes seondub rohkem antikehi ja säilib rohkem vabu antigeen-ensüümi konjugaate, mis suudavad hüdrolüüsida suure molekulmassiga substraati. Analüüs tehakse väga kiiresti, ühe määramise jaoks kulub 1 minut. Meetodi tundlikkus on üsna kõrge. Selle abil saate aine määrata pikomoolide tasemel.

Heterogeensete meetodite puhul on tüüpiline analüüs läbi viia kahefaasilises süsteemis, milles osaleb tahke faas - kandja ja immuunkomplekside eri faasides (moodustunud) reageerimata komponentidest eraldamise kohustuslik etapp (pesemine). immuunkompleksid on tahkel faasil ja reageerimata kompleksid on lahuses). Heterogeenseid meetodeid, mille puhul immuunkomplekside moodustumine esimeses etapis toimub tahke faasi alusel, nimetatakse tahkefaasi meetoditeks.

Meetodid klassifitseeritakse homogeenseteks-heterogeenseteks, kui 1. etapp - spetsiifiliste komplekside moodustumine toimub lahuses ja seejärel kasutatakse komponentide eraldamiseks tahket faasi immobiliseeritud reagendiga.

3. Vastavalt uuritava aine määramise põhimõttele:

A) Aine (antigeeni või antikeha) kontsentratsiooni otsene määramine sellega interakteeruvate sidumiskeskuste arvu järgi. Sel juhul on ensüümi märgis saadud spetsiifilises AG-AT kompleksis. Analüüdi kontsentratsioon on otseselt võrdeline registreeritud signaaliga.

B) Aine kontsentratsiooni määramine sidumissaitide koguarvu ja järelejäänud vabade seondumiskohtade erinevuse järgi. Sel juhul suureneb analüüdi kontsentratsioon ja salvestatud signaal väheneb, seega on sel juhul pöördvõrdeline sõltuvus salvestatud signaali suurusest.

ELISA-s kasutatud komponentide omadused.

Ensüümid.

Ensüümimärgistel on äärmiselt võimas katalüütiline toime, üks ensüümi molekul võib reageerida suure hulga substraadimolekulidega. Seega saab tühistes kogustes esinevat ensüümi tuvastada ja kvantifitseerida saaduste moodustumise ehk reaktsiooni kaudu, mida see katalüüsib. Ensüümide märgistusena kasutamise eeliseks on ka arvukate funktsionaalrühmade (sulfhüdrüül-, karboksüül-, türasiinijäägid jne) olemasolu molekulis, mille kaudu saab ligandimolekule kovalentselt siduda.

ELISA-s kasutatavatel ensümaatilistel markeritel peaksid olema järgmised omadused:

– ensüümi kõrge aktiivsus ja stabiilsus analüüsitingimustes, modifitseerimise ajal ja konjugatsioonis antikehade või muude valkudega;

– tundlike substraatide olemasolu ja ensümaatilise reaktsiooni produktide või substraatide määramise meetodi lihtsus;

– substraadisüsteemide kohandamise võimalus edasiseks tugevdamiseks;

- ensüümi ja selle inhibiitorite puudumine uuritavas bioloogilises vedelikus.

ELISA abil saab kasutada vähemalt 15 erinevat ensüümi. Ülaltoodud nõuete kohaselt on suurimaks kasutuseks mädarõika peroksidaas (HRP), aluseline fosfataas (AP) ja β-D-galaktosidaas (tabel 1). Kõik kolm on stabiilsed ja katalüüsivad väga tundlikke reaktsioone. Lisaks saab nende ensüümide poolt katalüüsitavate reaktsioonide saadusi olenevalt kasutatavast substraadist tuvastada mitte ainult kolorimeetriliste meetoditega, vaid ka fluorestsentsmeetoditega. Teisi ensüüme kasutatakse palju harvemini. See on seletatav nende madalama spetsiifilise aktiivsusega võrreldes HRP ja AP-ga.

Substraadid.

Substraadi valiku määrab eelkõige märgisena kasutatav ensüüm, kuna ensüümi-substraadi reaktsioon on väga spetsiifiline.

Põhinõuded aluspinnale:

– meetodi kõrge tundlikkuse tagamine ensüümi tuvastamisel konjugaadis;

– ensüüm-substraadi reaktsiooni täpselt määratletud (näiteks värviliste) produktide moodustumine;

– aluspind peab olema ohutu, odav, ligipääsetav ja mugav kasutada.

Tabel 1.

Ensüüme ja nende substraate kasutatakse ELISA-s enim.

Frement	Kviitungi allikas	MM. (kDa)	Substraat (soovitatav lainepikkus fotomeetria jaoks, nm)	Konjugeeriv reaktiiv
mädarõika peroksidaas	Mädarõigas (Armoracia rusticana)	40	O-fenüleendiamiindivesinikkloriid (OPD, 492 nm) 5-aminosalitsüülhape (450 nm), diaminobensidiin, o-dianisidiin.	Glutaraldehüüd Meta-perjodaadi naatrium N-suktsiinimidüül-3 (2-püridüülditio)propionaat
β-D-galaktosidaas	E. coli	540	O-nitrofenüül-β-D-galaktosiid (420 nm)	Meta-maleimidobenseen-N-hüdroksüsuktsiinimiidi ester
Leeliseline fosfataas	E. coli, vasika soole limaskest	84-150	P-nitrofenüülfosfaat (405 nm), 5-bromo-4-kloro-3-indolüülfosfaat	Glutaraldehüüd

Sagedamini kasutatakse kromogeenseid substraate, mis hävitamisel moodustavad värvilise aine. Paljutõotav on kõrge energiaga substraatide kasutamine - fluorestseeruvad, kemoluminestsents. Selliste substraatide kasutamine võimaldab teoreetiliselt tõsta ELISA tundlikkust kahe suurusjärgu võrra.

Antigeenid ja antikehad.

ELISA-s kasutatavad AG ja AT peaksid olema kõrgelt puhastatud ja väga aktiivsed. Lisaks peaks AG-l olema kõrge antigeensus, optimaalne tihedus ja antigeensete determinantide arv, võõras ja homogeensus. Paljud sünteetilised ja rekombinantsed viiruste ja bakterite antigeenid on end ELISA-s kasutades hästi tõestanud. See suurendas oluliselt meetodi spetsiifilisust ja reprodutseeritavust, minimeerides ristreaktsioone.

ELISA üks olulisemaid reaktiive on antikehad. ELISA tundlikkus sõltub kasutatavate antikehade kontsentratsioonist, aktiivsusest ja spetsiifilisusest. Kasutatavad antikehad võivad olla polü- või monokliinsed, erineva klassi (IgG või IgM) ja alamklassiga (IgGl, IgG2), anti-allotüüpsed või anti-idiotüüpsed. Madala AT afiinsuse korral viib AG-AT kompleksi lagunemine seotud AG eemaldamiseni süsteemist. Meetodi tundlikkust ja spetsiifilisust suurendab monoklonaalsete antikehade kasutamine. Sel juhul on võimalik tuvastada uuritavates proovides AG (AT) madalaid kontsentratsioone.

Konjugaadi moodustumine

Konjugaat on ensüümmärgisega märgistatud antigeen või antikeha. Konjugaadi moodustamine on ELISA üks olulisi etappe.

Konjugaadi moodustamisel valitakse selline optimaalne meetod ensüümi märgistuse sisestamiseks nii, et konjugaadi mõlemad komponendid säilitaksid oma bioloogilise aktiivsuse: ensüüm - võime suhelda substraadiga ja antigeen või antikeha - antigeensus ja antigeeniga seondumine. tegevust vastavalt. Märgistatud kõrgelt puhastatud antigeeni olemasolu võimaldab kasutada konkureerivaid meetodeid. Sel juhul saab lõppfaasis mõõta immobiliseeritud antikehadega seondumata konjugaadi aktiivsust, mis väldib pesemisprotseduuri ja muudab analüüsi mugavamaks. Antigeenid on aga oma füüsikalis-keemiliste omaduste ja struktuuri poolest mitmekesised, mistõttu on võimatu välja töötada universaalseid meetodeid antigeeniga konjugaadi saamiseks. Sel juhul on antigeen-ensüümi konjugaadi saamine eraldi väljakutse. Märgistatud antikehade valmistamine ELISA jaoks on metoodiliselt paremini kättesaadav.

Ensüümi konjugeerimine immunokeemiliselt aktiivsete valkudega toimub erinevate meetoditega: keemiline ristsidumine, ensüümi molekuli kovalentne sidumine AG või AT-ga ja ühendite moodustumine mittekovalentsete sidemete kaudu, näiteks siis, kui ensüüm ja AG või AT viiakse läbi immunoloogiliselt antigeeni-antikeha interaktsiooni kaudu.

Kõige laialdasemalt kasutatavad kovalentsed meetodid konjugaatide valmistamiseks. Sidumisreaktsiooni valiku määrab nendes valgusmolekulides saadaolevate funktsionaalrühmade tüüp. Glutaraldehüüdi, naatriumperjodaati jne kasutatakse reagentidena, mida kasutatakse ensüümi viimiseks antigeeni- ja antikehamolekulidesse.

Konjugaatide saamiseks glutaaraldehüüdi abil on olemas ühe- ja kaheetapilised meetodid. Võib moodustada erineva suurusega konjugaate, millel on vähenenud ensümaatiline aktiivsus (15–60% vabast ensüümist). Saadud suuremõõtmeline konjugaat võib steeriliselt takistada uuritava aine määramist. Suhteliselt madala molekulmassiga konjugaadid koosnevad Fab fragmendist ja ühest ensüümi molekulist.

Kaheetapilise sünteesi tulemusena, mis seisneb esmalt ristsiduva ainega modifitseeritud ensüümi etapiviisilises valmistamises, selle eraldamises ja seejärel selle järgnevas interaktsioonis antigeeniga (antikehaga), moodustuvad ensüümi molekulid. moodustuvad homogeensed koostised, mis sisaldavad 1-2 ensüümi molekuli immunoglobuliini molekuli kohta ning säilitavad kõrge ensümaatilise ja immunoloogilise aktiivsuse. Selliste konjugaatide hulk on aga väike (mädarõika peroksidaasi puhul 5–10%).

Suurima praktilise rakenduse on leidnud immunoperoksidaasi konjugaatide saamise meetod, mis põhineb ensüümi süsivesikute komponendi oksüdeerimisel naatriumperjodaadiga (peroksidaasi seondumine konjugaadiga ulatub 70-90% ensüümi esialgsest kogusest).

Usaldusväärsel konjugaadil peavad olema järgmised omadused:

Kõrge antikehade tiiger ja kõrge afiinsus antigeeni suhtes, nii et seda saab kasutada suures lahjenduses ja seega vähendada mittespetsiifilist seondumist;

Piisav spetsiifilisus tööaretuses;

Monomeersete vormide ülekaal polümeersete üle, sest polümeersed vormid kipuvad plastiga mittespetsiifiliselt kleepuma, mille tulemuseks on reaktsiooni kõrge tausttase;

Optimaalne molaarsuhe ensüümi ja antikehade vahel (optimaalne suhe on umbes 1:1);

Konjugaadi piisav ensümaatiline aktiivsus. Selle omaduse määravad peamiselt konjugatsiooni tingimused ning ensüümi ja antikeha molekulide suhe konjugaadis.

tahke faas

ELISA jaoks võib tahke faasina kasutada erinevaid materjale: polüstüreeni, polüvinüülkloriidi, polüpropüleeni ja muid aineid. Tahkeks faasiks võivad olla katseklaasi seinad, 96 süvendiga ja muud plaadid, pallid, helmed, aga ka nitrotselluloos ja muud membraanid, mis aktiivselt valke absorbeerivad.

Antigeeni või antikehade immobiliseerimine tahkel faasil on võimalik kolmel viisil:

– passiivne adsorptsioon, mis põhineb tugevatel hüdrofoobsetel interaktsioonidel valkude ja sünteetilise pinna vahel;

– kovalentne kinnitumine tahke faasi külge;

– immunokeemiline jne (mittekovalentne ja mitteadsorptsioonkinnitus).

Valkude passiivset adsorptsiooni kasutatakse laialdaselt ELISA läbiviimisel tiitrimisplaatidel, nitrotselluloosmembraanidel. Passiivne adsorptsioon järgib küllastuse põhimõtet ja korreleerub adsorbeeritud aine molekulmassiga. Erinevat tüüpi membraanide (nitrotselluloos, nailon jne) adsorptsioonipind on 100-1000 korda kõrgem kui plastil.

Polüsahhariididel ja kõrgelt glükosüülitud valkudel on sageli madal afiinsus polüstüreeni suhtes. Nende immobiliseerimiseks on vaja muid meetodeid, näiteks kovalentset kinnitamist glutaaraldehüüdiga. Kovalentne kinnitus on efektiivne, kui tahke faasina kasutatakse hüdrofiilseid helmeid (agaroos) ja polüstüreenhelmeid.

Immunokeemilised meetodid põhinevad eelnevalt adsorbeeritud "lõksu" antikehade kasutamisel antigeeni või antikehade immobiliseerimiseks. Immunokeemiliselt immobiliseeritud antigeen on 10 korda aktiivsem kui passiivselt adsorbeeritud antigeen. Võib kasutada lektiine või bakterite immunoglobuliini siduvaid valke, mis on kergesti adsorbeeruvad plastile või muudele hüdrofoobsetele pindadele, nagu konkanavaliin A (Con A) või stafülokoki valk A. Con A on võimeline immobiliseerima HIV viiruse gp 120 valku.

Tahke faasi pinnal olevad vabad kohad, mis ei ole sorbeeritud ainega seondunud, võivad testi käigus fikseerida teisi molekule, sealhulgas konjugaate, mis viib taustsignaali suurenemiseni. Et vältida mittespetsiifilist seondumist pärast immobiliseerimist alusmaterjali tahkele faasile, töödeldakse ainetega, mis on testi jaoks neutraalsed. Kõige populaarsemad blokeerivad ained on veise seerumi albumiin (BSA), kaseiin jne. Blokeeriva aine valik ja selle etapi tingimused sõltuvad tahke faasi tüübist ja süsteemi tundlikkusest.

ELISA lavastusvõimalused.

Üldine põhimõte.

Praegu kasutatakse tohutul hulgal erinevaid ELISA sorte ja modifikatsioone. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) erinevad variandid on laialt levinud.

Tahkefaasiline ELISA pakuti välja 1971. aastal. Tahkefaasilise ELISA põhiprintsiibid, olenemata modifikatsioonist, on järgmised:

1. Reaktsiooni 1. etapis adsorbeeritakse antigeenid või antikehad tahkele faasile. Sel juhul on tahke faasiga mitteseotud reagendid kergesti eemaldatavad pesemisega.

2. Uuritavat proovi inkubeeritakse sensibiliseeritud süvendites. Positiivse kontrolli süvendid sisaldavad standardseid reaktiive. Sel juhul moodustuvad immuunkompleksid tahke faasi pinnal. Seondumata komponendid eemaldatakse pesemise teel.

Sarnased kokkuvõtted:

Veregrupi määramine, Rh-kuuluvus, erütrotsüütide antigeenide tüpiseerimine ja erütrotsüütide vastaste antikehade tuvastamine tuleb läbi viia mitte ainult profülaktikaks.

Lümfoidsüsteemi rakud: interaktsioon immuunvastuse kujunemisel; füsioloogilise reguleerimise viisid.

KLAMÜDIOOS – KAASAEGSED LÄHENEMISVIISID DIAGNOOSIL JA RAVIMISEL Tsütoskoopilised meetodid klamüüdia tuvastamiseks Tsütoskoopilisel meetodil, samaaegselt Provacheki tsütoplasmaatiliste inklusioonrakkude otsimisega, ...

Varasemate raseduste esinemine, nende ebasoodne tulemus (raseduse katkemine, surnultsündimine, HDN-ga laste sünd), samuti anamneesis vereülekanne seab naised ohtu vastsündinu hemolüütilise haiguse tekke.

Antigeeni-antikeha interaktsiooni peamised ilmingud. Antigeenide ja antikehade immunoloogiline analüüs, kasutades märgistatud reagente. Komplemendi tegevuse olemus. Efektorrakkude määramise meetodid. Transgeensed loomad ja suunatud geenide kohaletoimetamine.

Elektrokeemiliste ja optiliste meetodite kasutamine immunoloogiliste reaktsioonide tuvastamiseks pideval pinnal ja nende rakendamine kliiniline praktika. Levivate lainete genereerimine, fluorestsentsi sisemise täieliku peegelduse meetod.

Peroksidaasi märgise määramine tugevdatud kemoluminestsentsi abil. Ensüümi immuunanalüüsi kiirmeetodite väljatöötamine, mis viiakse läbi kaasaskantavate seadmete abil. Sünergia ja täiustamise aste. Valguse emissiooni intensiivsus ja kestus.

Laboratoorse diagnostika tunnused viirusnakkused kasutades elektronmikroskoopiat. Mõjutatud koe lõikude ettevalmistamine uurimiseks. Immunoelektronmikroskoopia meetodi kirjeldus. Immunoloogilised uurimismeetodid, analüüsi käigu kirjeldus.

Immuunanalüüsi meetodite ja tehnikate täiustamine, kombineerimine ja laiendamine. Antikehade avastamine ja tuvastamine, nende võime põhjustada aglutinatsiooni. Automatiseeritud kompleksi kasutamine immuunanalüüsiks lateksi aglutinatsiooniga.

Avidiini-biotiini reaktsiooni kasutamine kahekeskuselises immuunanalüüsis. Immobiliseeritud ja biotinüülitud antikehade preparaatide valik erinevate antigeeniepitoopide äratundmise teel. Avidiini ja streptavidiini omadused, biotinüülitud valkude saamine.

Radioimmunoanalüüsi ja immunoradiomeetrilise analüüsi meetodid. Immuunanalüüsi kasutusvaldkonnad veterinaarmeditsiinis, immuundiagnostika komplektide tarbijad. Veiste viljakuse ja viljakuse diagnoosimine. Immunoanalüüsi arendamine veterinaarmeditsiinis.

Meetod põhineb antikeha või hapteeni konjugeerimisel ensüümiga, mis ei too kaasa antikeha või hapteeni spetsiifilisuse kadu ja ensüümi katalüütilise aktiivsuse kadu. Kuid antigeen-antikeha kompleksis kaotavad hapteen-ensüümi või antikeha-ensüümi konjugaadid oma katalüütilise aktiivsuse.

Antikehamolekulide ühendamine ensüümiga toimub peamiselt glutaaraldehüüdi abil, mis on bifunktsionaalne reaktiiv, mis interakteerub valgu molekulide E-aminorühmadega. Olenevalt meetodi modifikatsioonist kasutatakse ensüümina edukalt kas peroksidaasi, β-galaktosidaasi, aluselist ja happelist fosfataasi (harvemini atsetüülkoliin, glükoamülaas, glükoosoksüdaas) või lüsosüümi, glükoos-6-fosfaatdehüdrogenaasi ja malaatdehüdrogenaasi. meetodi muutmise kohta. Antikehade märgistamiseks kasutatav ensüüm ei tohiks antigeeni sisaldavates testrakkudes esineda, kuna endogeenne ensümaatiline aktiivsus ei ole lubatud.

ELISA läbiviimiseks on palju võimalusi. Eristage homogeenset ja heterogeenset ELISA-d. Madala molekulmassiga ainete (hapteenide) määramiseks kasutatava homogeense ELISA aluseks on ensüümi aktiivsuse pärssimine selle kombineerimisel hapteeniga (ensüümi aktiivsus taastub AG-AT reaktsiooni tulemusena) või vastupidi markerensüümi aktiivsuse kaotus AG-AT reaktsiooni tagajärjel. Seetõttu eemaldatakse vaba AG segust, mis sisaldab AG-d köidetud vorm, immuunkomplekside osana on võimatu. Seevastu heterogeense ELISA-ga fikseeritakse AG või AT tahkele faasile (tavaliselt plastile) ja reageerimata reaktsioonikomponendid eemaldatakse korduva pesemisega.

ELISA-s eristatakse konkureeriva ja mittekonkureeriva analüüsi meetodeid.

Konkurentsivõimelist ELISA-d saab läbi viia, kui on vaja kvantifitseerida antigeeni, mida saab puhtal kujul. Esimene samm on sel juhul antikeha kinnitumine kandja külge keemilise reaktsiooni või füüsikalis-keemiliste interaktsioonide tõttu. Liigne antikeha eemaldatakse pesemise teel ning rangelt määratletud koguse märgistatud antigeeni ja sihtantigeeni koguse erinevuse sisestamisega koostatakse kalibreerimiskõver. Reaktsiooni lõppedes kinnituvad AG-AT immuunkompleksid antikeha toimel tahke faasi külge ja liigne antigeen eemaldatakse pesemise teel, lisatakse substraat ensüümi jaoks, reaktsioon peatatakse teatud aja möödudes. ja viiakse läbi ensümaatilise reaktsiooni produktide kolorimeetriline määramine.

Teises konkureerivas ELISA-s on antigeen peamiselt seotud tahke faasiga. Pärast pesemist lisatakse ensüümiga märgistatud antikehad ja standard- või testantigeen. Märgistatud antikehade seondumist inhibeerib konkureerivalt lahustunud antigeen. Ensümaatiliste reaktsiooniproduktide kogus on pöördvõrdeline lahustunud antigeeni kontsentratsiooniga.

Mittekonkureerivad meetodid hõlmavad topeltantikeha meetodit või, nagu seda mõnikord nimetatakse "võileivameetodiks".

Tahkefaasi fikseeritud antikehi inkubeeritakse standardse või analüüdi antigeeniga. Pärast pesemist lisatakse liig märgistatud antikehi (spetsiifilised samale antigeenile) ja kleepunud antikehad pestakse maha. Ensümaatilise reaktsiooni saadus moodustub kogustes, mis on võrdelised seotud antigeeni kogusega. Üsna sageli kasutatakse märgistamata sekundaarseid antikehi; reaktsiooni hinnatakse sel juhul ensüümiga märgistatud IgG suhtes spetsiifiliste antikehade (teised antikehad) seondumise järgi. Igal juhul peavad esimene ja teine ​​antikeha kuuluma eri liiki loomadele. Antikehade tuvastamiseks kasutatakse ensüümi immuunanalüüsis sageli kaudset, mittekonkureerivat ELISA-d.

Antigeen fikseeritakse tahkele faasile, pärast pesemist inkubeeritakse antikeha lahusega. Kui on toimunud antikehade spetsiifiline seondumine, saab neid kvantifitseerida, kasutades ensüümiga märgistatud antiglobuliini seerumit, mis on ensümaatiline reaktsioon.

Lisaks kirjeldatutele on teada järgmised tahke faasi ELISA modifikatsioonid. Selle asemel, et inkubeerida märgistatud ja märgistamata antigeene seotud antikehadega, võib otse inkubeerida ainult standardset või analüütilist antigeeni ja seejärel pärast pesemist inkubeerida ensüümiga märgistatud antigeeni liiaga, mis interakteerub "mitte hõivatud" antikehadega.

Lisaks võib standardset või testitavat antigeeni inkubeerida ensüümiga märgistatud antikehade liiaga ja lõpuks immuunvastus lisage see segu tahkel faasil fikseeritud antigeenile. Määratakse tahkel faasil oleva antigeeniga seotud vabade ensüümiga märgistatud antikehade kogus. Mõlemal juhul on ensümaatilise reaktsiooni produkti kontsentratsioon võrdeline analüüsitava antigeeni kontsentratsiooniga. Tulemusi võetakse arvesse fotomeetriliselt.

Hetkel vabastatud suur hulk mitmesugused ELISA diagnostikakomplektid antikehade tuvastamiseks seerumis või muudes bioloogilistes vedelikes ja antigeenide tuvastamiseks. Viimased võivad olla haigustekitajad mitmesugused haigused(coxsackie B viirused, A- ja B-hepatiit, AIDS, herpes simplex, punetised; brutsella, vibrio cholerae, salmonella, treponema, E. coli), samuti mitmesugused valgud, mille sisalduse määramine veres või eritises on diagnostiliselt huvipakkuvad (autoantikehad, mittespetsiifilise kaitse tegurid, hormoonid, tsütokiinid, ägeda faasi valgud jne).

Metoodika. ELISA jaoks on vaja järgmisi puhverlahuseid.

1. Kinnitage puhver- 0,05 M naatriumkarbonaat-vesinikkarbonaatpuhver (CBB) (pH 9,5-9,7) antigeeni või antikehade sorptsiooniks tahkel kandjal. Puhvri koostis: 1,18 g Na2CO3; 3,47 g NaHC03; 200 mg NaNO3. Puhvri maht reguleeritakse destilleeritud veega 1 liitrini.

2. Inkubatsioonipuhver- fosfaat-soolalahus (pH 7,3-7,5), mida kasutatakse reaktsioonisegusse viidud komponentide lahjendamiseks pärast esimese komponendi sorptsiooni kandjale. Puhvri koostis: 17,9 g Na2HPO4´12H2O; 0,8 g NaH2PO4´2H20; 42,5 g NaCl; 2,5 ml Tween-20. Puhvri maht reguleeritakse destilleeritud veega 5 liitrini, säilitatakse temperatuuril 20-25 C.

3. pesupuhver- isotooniline naatriumkloriidi lahus, mis sisaldab 0,05% Tween-20. Pesupuhvrina võib kasutada ka fosfaatsoolalahust 0,05% Tween-20-ga. Peroksidaasi substraadiks on ortofenüleendiamiin või 5-aminosalitsüülhape.

Ortofenüleendiamiin valmistatakse ex tempore järgmiselt: 10 mg ortofenüleendiamiini, 6,1 ml 0,1 M sidrunhapet, 6,4 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 × 12H 2 O (täielikuks lahustumiseks kuumutatakse veevannis), 12, 5 ml destilleeritakse vesi, 0,35 ml 3% H2O2.

Lahustage 80 mg 5-aminosalitsüülhapet 100 ml destilleeritud vees, reguleerige lahuse pH ex tempore 1 M NaOH-ga 6,0-ni. Enne kasutamist lisage iga 9 ml lahuse kohta 1 ml 0,05% H 2 O 2 .

ELISA jaoks on vaja tasase põhjaga süvenditega polüstüreenplaate ja automaatseid pipette. Kvantitatiivseks arvestuseks kasutatakse spektrofotomeetrit - ekstinktsiooniregistraatorit lainepikkusel 492 nm.

reaktsioonitehnika. ELISA esimene etapp on antikehade või antigeeni sobiva lahjenduse sorptsioon (kontsentratsioonil 10-20 μg / ml) karbonaat-vesinikkarbonaatpuhvris mahus 0,2 ml tahke faasi kohta 1-2 tunni jooksul temperatuuril. temperatuuril 37 °C ja 10-12 tundi temperatuuril 4 °C. Seejärel pestakse süvendeid (kandjale adsorbeerimata antikeha või antigeeni eemaldamiseks) kraaniveega, pesupuhvriga 0,05% Tween-20-ga 5 minutit (2 korda) toatemperatuuril. Seejärel lisatakse igasse süvendisse 0,2 ml veise seerumi albumiini 1% lahust CBB-l ja inkubeeritakse 1 tund temperatuuril 37 °C, et katta kaevude pinnad, mis jäävad pärast esimese sorptsiooni vabaks. reaktsiooni komponent tahkele kandjale. Süvend pestakse seomata veise seerumi albumiinist ja uuritav materjal (antigeen või antikehad) lisatakse 0,2 ml lahjendustes fosfaat-soolalahuses (pH 7,2) 0,05% Tween-20-ga. Materjali iga lahjendus süstitakse kahte süvendisse ja asetatakse termostaadi 1-3 tunniks temperatuurile 37 °C. Antigeenid või antikehad, mis ei ole immuunreaktsioonis reageerinud, pestakse maha ja lisatakse 0,2 ml konjugeeritud antikehi uuritava antigeeni või antikehade vastu töölahjenduses fosfaat-soolalahuses 0,05% Tween-20-ga. Seejärel inkubeeritakse neid 2 tundi 37 °C juures. Seondumata konjugaati pestakse puhvriga 3 korda 10 minuti jooksul.

Süvendisse lisatakse 0,1 ml substraadi lahust (kromogeeni) ja inkubeeritakse 30 minutit pimedas toatemperatuuril. Peroksidaasi juuresolekul inkubeerimisel muutub ortofenüleendiamiin kollane, ja aminosalitsüülhape - pruunis.

Substraadi poolitamise reaktsiooni peatamiseks süvendis lisage 0,1 ml 1 M NH 2 SO 4 (või 1 M NaOH).

Reaktsiooni kontroll – uuritav antigeen või antikehad asendatakse reaktsiooni homoloogse komponendiga.

Konjugaadi kontroll - 0,2 ml 1% veise seerumi albumiini CBD-l + 0,2 ml konjugeeritud antikehi töölahjenduses.

Reaktsioonitulemusi võetakse arvesse visuaalselt või instrumentaalselt. Kui visuaalne arvestus näitab uuritava materjali kõrgeima lahjenduse, mille värvus on intensiivsem kui kontrollproovil (veise seerumi albumiin). Võttes arvesse spektrofotomeetriga reaktsiooni tulemusi, loetakse positiivseks uuritava materjali kõrgeim lahjendus, kus ekstinktsioonitase ületab vähemalt 2 korda heteroloogse reaktsioonikomponendi vastava lahjenduse ekstinktsioonitaseme.