Polümeraas ahelreaktsioon(PCR)- molekulaarbioloogia eksperimentaalne meetod, mis on sünteetiliste oligonukleotiidpraimerite poolt indutseeritud nukleiinhapete spetsiifiline amplifikatsioon in vitro.

PCR-meetodi väljatöötamise idee kuulub Ameerika teadlasele Kary Mullisele, kes lõi 1983. aastal meetodi, mis võimaldas tsükliliste kahekordistumiste käigus DNA-d amplifitseerida DNA polümeraasi ensüümi abil. kunstlikud tingimused. Mõni aasta pärast selle idee avaldamist, 1993. aastal, sai K. Mullis selle eest Nobeli preemia.

Meetodi kasutamise alguses pärast iga silmust küte-jahutus Reaktsioonisegule tuli lisada DNA polümeraas, kuna see inaktiveerus kõrgel temperatuuril kiiresti. Protseduur oli väga ebaefektiivne, nõudes palju aega ja ensüümi. 1986. aastal muudeti seda oluliselt termofiilsete bakterite DNA polümeraasi abil. Need ensüümid on võimelised vastu pidama paljudele reaktsioonitsüklitele, mis võimaldab teil PCR-i automatiseerida. Bakteritest on eraldatud üks kõige sagedamini kasutatavaid termostabiilseid DNA polümeraase. Thermus aquaticus ja nimega Taq-DNA polümeraas.

Meetodi olemus. Meetod põhineb teatud DNA piirkonna mitmekordsel selektiivsel kopeerimisel ensüümi Taq-DNA polümeraasi abil. Polümeraasi ahelreaktsioon võimaldab saada kuni mitme tuhande aluspaari pikkuseid amplifikaate. PCR-produkti pikkuse suurendamiseks 20-40 tuhande aluspaarini kasutatakse erinevate polümeraaside segu, kuid see on siiski palju väiksem kui eukarüootse raku kromosomaalse DNA pikkus.

Reaktsioon viiakse läbi programmeeritavas termostaadis (võimendis) - seadmes, mis suudab piisavalt kiiresti läbi viia

katseklaaside jahutamine ja soojendamine (tavaliselt täpsusega vähemalt 0,1 °C). Võimendid võimaldavad seadistada keerulisi programme, sealhulgas neid, millel on "kuumkäivituse" ja sellele järgneva salvestamise võimalus. Reaalajas PCR jaoks toodetakse fluorestsentsdetektoriga varustatud seadmeid. Instrumendid on saadaval ka automaatse kaane ja mikroplaadi kambriga, mis võimaldab neid integreerida automatiseeritud süsteemidesse.

Tavaliselt tehakse PCR-i käigus 20-45 tsüklit, millest igaüks koosneb kolmest etapist: denatureerimine, praimeri anniilimine, elongatsioon (joonis 6.1 ja 6.2). Joonisel fig. 6.1 näitab katseklaasi temperatuurimuutuste dünaamikat PCR tsükli ajal.

Riis. 6.1. Temperatuuri muutuse graafik katseklaasis ühe polümeraasi ahelreaktsiooni tsükli jooksul

DNA matriitsi denatureerimine Kuumutatakse reaktsioonisegu temperatuurini 94–96 °C 5–90 sekundiks, nii et DNA ahelad hajuvad. Tuleb märkida, et enne esimest tsüklit kuumutatakse reaktsioonisegu esialgse maatriksi täielikuks denatureerimiseks 2–5 minutit, mis võimaldab vähendada mittespetsiifiliste reaktsioonisaaduste hulka.

Riis. 6.2. Polümeraasi ahelreaktsiooni esimese tsükli skeem

Praimeri lõõmutamise etapp. Temperatuuri järkjärgulise langusega seonduvad praimerid matriitsiga komplementaarselt. Lõõmutamistemperatuur sõltub praimerite koostisest ja on tavaliselt 4-5°C madalam kui arvutatud sulamistemperatuur. Etapi kestvus on 5-60 s.

Järgmise etapi jooksul - pikenemine- emamaatriksil toimub DNA tütarahela süntees. Pikendustemperatuur sõltub polümeraasist. Tavaliselt kasutatavad Taq ja Pfu DNA polümeraasid on kõige aktiivsemad 72 °C juures. Pikenemisaeg, mis sõltub peamiselt PCR-produkti pikkusest, on tavaliselt 1 minut 1000 aluspaari kohta.

Sisu

Uute diagnostikameetodite huvilised peaksid uurima, mis on PCR meetod. Valdkonnas kaasaegsed tehnilised võimalused laboriuuringud annab võimaluse avastada paljusid haigusi esialgsed etapid. Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) peetakse praegu kõige täpsemaks ja uuemaks meetodiks.

PCR analüüs

PCR analüüs - mis see on? See meetod kasutab molekulaarbioloogia põhimõtteid. Materjali uurimiseks kasutatakse spetsiaalseid ensüüme, mis kopeerivad korduvalt ja kiiresti patogeenide DNA, RNA fragmente. Olemas erinevad tüübid PCR analüüs sõltuvalt uuritavast materjalist (veri, uriin, väljaheited jne). Pärast töötlemist võrdlevad laboritöötajad tulemust andmebaasiga, tuvastavad kontsentratsiooni, patogeeni tüübi.

PCR analüüs asetatakse spetsiaalsesse võimendisse (seadmesse), mis soojendab ja jahutab katseklaase koos biomaterjaliga. Fragmentide replikatsiooniks on vaja temperatuurimuutusi. Tulemuse täpsus sõltub temperatuurirežiimi täpsusest. Polümeraasi ahelreaktsiooni meetod aitab tuvastada:

• Nakkuslik mononukleoos;
• tsütomegaloviiruse infektsioon;
• viirushepatiit G, C, B, A;
• sugulisel teel levivad infektsioonid / haigused (STI-d / STD-d): gardnerelloos, trikhomoniaas, ureaplasmoos;
• herpeetiline infektsioon;
• onkogeensed viirused;
• listerioos;
• helikobakteri infektsioon;
• puukentsefaliit, borrelioos;
• tuberkuloos;
• kandidoos.

Veri

Hetkel on tehnoloogia uudsuse tõttu PCR vereanalüüsil veel kõrge hind. Biomaterjali ettevalmistamisel ei ole vaja järgida teatud nõudeid. Isegi põhjustatud kehaline aktiivsus, stress, toitumise muutus, koostise muutused ei mõjuta uuringu tulemust. PCR-vereanalüüs võib rikkuda ainult antibakteriaalsete ainete tarbimist, seetõttu tuleb enne selle võtmist teha paus ravi ja testi vahel.

PCR-vereanalüüs on kõige levinum võimalus viirusliku või ebatüüpilise ilminguga krooniliste, ägedate nakkuspatoloogiate diagnoosimiseks. Seroloogiliste uurimismeetodite läbiviimisel on teatud raskused - patogeeni olemasolu määrab antikehade olemasolu inimkehas. Tulemus võib olla valenegatiivne, kui patsiendi seisund ei andnud aega nende arenguks.

määrima

Günekoloogia valdkonnas kasutatakse nakkusohtlike mikroorganismide esinemise uurimiseks PCR-määrianalüüsi. Materjaliga töötamine toimub samal põhimõttel nagu verega: patogeeni DNA fragmentide mitmekordne suurenemine, et seda hõlpsalt tuvastada. See aitab ka avastada varjatud infektsioonid naise juures. Analüüsiks võib võtta erinevaid bioloogilisi vedelikke: sülge, röga, uriini, verd. Günekoloogias kasutatakse määramise täpsuse huvides sagedamini emakakaela kanalist tupe limaskesta määrdumist.

PCR-i jaoks on teatud näidustused. Sageli tuleb seda teha antibiootikumiresistentse patogeeni tüübi tuvastamiseks. Naistel on selle meetodi abil diagnoosimise peamised näidustused järgmised:

• raske rasedus;
• STI-de äge faas;
• kui on kahtlus sugulisel teel levivate nakkuste ülekandumise kohta krooniline staadium;
• viljatuse põhjuste otsimine.

Cala

Nakkuse tuvastamiseks võib arst määrata väljaheite PCR-testi. Pärast testi kõige usaldusväärsemate tulemuste saamiseks tuleb enne biomaterjali võtmist järgida järgmisi reegleid:

• lõpetage mõneks päevaks lahtistite võtmine: õlid, suposiidid;
• välja jätta ravimid, mis annavad väljaheitele kindla värvi, näiteks rauasisaldusega.

Uriin

Vajadusel võib arst analüüsiks võtta uriini. Kõrge täpsus avab võimaluse töötada mis tahes bioloogilise vedelikuga, millest on võimalik eraldada viiruse DNA. PCR uriinianalüüsi läbimiseks peate enne materjali võtmist järgima järgmisi piiranguid:

• vähemalt 1 päev enne protseduuri lõpetada seksuaalvahekord;
• 3 nädalat enne sünnitust tuleks lõpetada igasugune antibakteriaalne ravi, sest ravimid ähmastavad pilti;
• peate testi tegema tühja kõhuga (ka vedelik on keelatud);
• peate võtma materjali esimese hommikuse osa.

PCR testi tulemused

Eelnevast on selge, mis on PCR analüüs ja selle uurimismeetodi selged eelised on nähtavad. Selle diagnostilise protseduuri teine ​​pluss on tulemuste dešifreerimise lihtsus. Arvestades, kui palju PCR-analüüsi tehakse (protsess ise võtab aega umbes 5 tundi, kuid labor väljastab andmed 1-2 päevaga), muutub see diagnostikameetod parimaks võimaluseks paljude infektsioonide määramiseks. Tulemuste põhjal võib arst teile öelda, et test:

1. Negatiivne - uuritud materjal ei sisaldanud soovitud patogeeni.
2. Positiivne - leiti patogeeni RNA, DNA.

Mõnikord tehakse mikroorganismide kvantitatiivne määramine. See on vajalik haiguste puhul, mis põhjustavad oportunistlikke patogeene. Nende viiruste eripära on see, et neid esineb ainult ülemääraselt ja tavauuringutega on nende leidmine äärmiselt problemaatiline. See tegur on valimisel oluline terapeutiline taktika viirusinfektsioonide, nagu hepatiit, HIV, tõhusaks raviks.

12 infektsiooni korral

Et täielikult mõista, mis PCR on infektsioonide diagnoosimiseks ja kui tõhus see on, peate teadma, et see on võimeline eraldama kuni 12 patogeeni. Tekst viiakse läbi ainult laboritingimustes. Uurimiseks kasutatakse spetsiaalseid ensüüme, mis suurendavad kordades RNA, viiruse DNA fragmentide hulka. 12 infektsiooni PCR-analüüs võib paljastada:

• mycobacterium tuberculosis;
• tsütomegaloviirus;
• hepatiit C, G, B, A;
• herpes 1, 2 tüüpi;
• Epsteini-Barri viirus (nakkuslik mononukleoos);
• sugulisel teel levivad infektsioonid, näiteks klamüüdia;
• listerioos;
• Candida infektsioon;
• helicobacter pylori;
• borrelioos, puukentsefaliit.

C-hepatiidi korral

See diagnostiline meetod aitab kindlaks teha viiruse olemasolu veres. See annab arstidele võimaluse rääkida selle olemasolust või puudumisest. C-hepatiidi PCR analüüsi on kahte tüüpi: kvalitatiivne ja kvantitatiivne. Esimene valik näitab ainult selle olemasolu ja võib olla sõnastatud "tuvastatud" / "ei tuvastatud". Seda tüüpi testi tundlikkus on 10-500 IU/ml. See viitab sellele, et patogeeni vähese sisalduse korral kehas analüüsi "ei tuvastata".

Kvantitatiivne analüüs on täpsem ja näitab infektsiooni kontsentratsiooni veres. Seda indikaatorit nimetatakse "viiruskoormuseks", mõõdetuna viiruse RNA koguses vere konkreetse mahu kohta. Dekrüpteerimine erinevates laborites võib erineda. Lisaks mõõtmisele IU / ml kasutatakse "koopia" ühikuid. Saate ümber arvutada koopiad RÜ kohta, kasutades valemit: 1 IU = 4 koopiat. Kui transkriptis ületab viiruse esinemise väärtus 800 000 RÜ / ml (või 800 * 103), näitab see patogeeni suurt sisaldust.

Tuberkuloosi vastu

Katse tuleks teha hommikul. See on oluline selleks, et vältida kogu öö jooksul tekkinud röga maost väljumist. Tuberkuloosi PCR-analüüs on sama oluline kui ELISA, Mantoux, tomograafia. Test aitab esile tuua mükobakterite olemasolu, uriini seisundit, kogu immunoglobuliin, ESR, määrake hetkeseisund kopsudes. PCR-analüüsi tulemuste täpsuse tagamiseks tuleb see läbi viia vastavalt järgmistele reeglitele:

1. Külvamine toimub 3 korda, kuid mao sisu täielikku aspireerimist tuleks läbi viia ainult haiglas.
2. Tuvastab mükobakterid maos olemasolevate masside külvi abil vähem kui 50% diagnoosidest. Isegi optimaalsete tingimuste saavutamisel soovitatakse selle asemel teha ultraheli.
3. Isegi negatiivse tulemuse korral ei saa täielikult välistada tuberkuloosi tekke tõenäosust ESR-i, immunoglobuliini või muude näitajate muutumisega.
4. PCR-i külv on patoloogiliste seisundite suhtes vähem vastuvõtlik, kui see on saadud bronhoskoopilise uuringu käigus, mis välistab lapse tuberkuloosi kahtluse.

HIV-i jaoks

Paljude inimeste jaoks peetakse seda diagnoosi surmaotsuseks. Sel põhjusel muutub inimene pärast sagedast seksuaalvahekorda tähelepanelikumaks signaale, mida tema keha annab (ja mõnikord tuleb nendega välja). Kõige usaldusväärsem võimalus selle haiguse kinnituse või ümberlükkamise saamiseks on HIV-i PCR-test. Testi abil saab kindlaks teha järgmist võimalikud probleemid tervisega:

1. HIV-i esinemise eitamine/kinnitamine seronegatiivse hobuse perioodil.
2. HIV-1, HIV-2 genotüübi määramine.
3. Immunobloti kahtlase tulemusega patoloogilise protsessi kirjelduse selgitamine.
4. Infektsioon pärast vereülekannet.
5. HIV-staatuse määramine kandjatest emadel sündinud lastel.
6. Aitab sisse seada organismi viiruskoormuse jälgimise.

HPV jaoks

Papilloomiviirust saab tuvastada igal inimesel, pikka aega võib see olla varjatud olekus. Areng kutsub esile immuunsüsteemi nõrgenemise, stressi või emotsionaalseid puhanguid. HPV PCR-analüüs aitab määrata viiruse kontsentratsiooni veres. Sel põhjusel on soovitatav teha kvantitatiivne, mitte kvalitatiivne määramine. Need andmed aitavad ennustada infektsiooni pahaloomulise olemuse tekkimise tõenäosust.

HPV olemasolu diagnoosimise tehnika põhineb PCR-i peamisel omadusel eraldada materjalist viiruse DNA. Testi kõrge tundlikkuse tõttu tuvastatakse isegi väike kogus baktereid. Kvantitatiivsed uuringud annavad arstidele võimaluse määrata haiguse ohtlikkuse aste, teha prognoos tulevikuks. See diagnoos on kohustuslik kõigile meestele ja naistele, kellel on tüükad. Kvantitatiivne PCR-analüüs aitab kindlaks teha, mis põhjustas HPV arengu: ajutine immuunsuse vähenemine või krooniline haigus.

Herpese puhul

Seda tüüpi diagnostika mikrobioloogias aitab suure täpsusega läbi viia herpese PCR-analüüsi. Viiruse DNA fragmentide kopeerimine toimub ainult siis, kui materjalis on soovitud geen. Sel juhul võib käitumise tulemuste põhjal tehtud test viidata patogeeni olemasolule või puudumisele. Seda on võimalik tuvastada isegi madala kontsentratsiooni korral veres.

Teine PCR-analüüsi pluss on see, et see suudab tuvastada herpesviiruse infektsiooni kohe pärast nakatumist, enne kliiniliste sümptomite ilmnemist. Herpese tüüpi (1 või 2) on võimalik määrata, analüüsi läbimiseks ei ole vaja spetsiaalset ettevalmistust, kuid arstid soovitavad enne vere võtmist keelduda:

• praetud;
• äge;
• alkohol;
• paksuke.

Raseduse ajal

Lapse kandmisel on väga oluline see uuring et võtta arvesse naise seisundit. PCR analüüs raseduse ajal on üks kõige tõhusad meetodid erinevate haiguste esinemise määramine. Testi on vaja läbi viia mitte ainult patoloogiate tuvastamiseks, vaid ka lapse emakasisese nakatumise tõenäosuse kindlakstegemiseks. Ainult tänu PCR-diagnostikale sai võimalikuks tuvastada progresseerumise aste, paljude infektsioonide areng emaüsas.

PCR analüüside kohaletoimetamine

Kui soovite teada, kuidas PCR-analüüsi tehakse, tuleks kaaluda iga üksikjuhtumit, võttes arvesse biomaterjali tüüpi. Kraapimisel, määrimisel või vereproovide võtmisel on oma omadused, näiteks:

• plasma annetatakse hommikul;
• uriin võetakse ainult hommikul, laboritingimustes steriilses anumas;
• määrimine või kraapimine on näitlik alles pärast seksuaalvahekorrast hoidumist vähemalt 3 päeva;
• te ei saa määrida menstruatsiooni ajal ja 2 päeva pärast seda.

Kust saada PCR-testi

Seda tüüpi uuringud viitavad kaasaegsetele ja kõrgtehnoloogilistele diagnostikameetoditele. PCR-testid tuleks teha laborites, kus on täielike tulemuste saamiseks kõik vajalikud kompleksid. Sama oluline roll on kvalifitseeritud ja koolitatud personalil. Eelistage suuri, tõsiseid, tuntud laboreid. See aitab mitte ainult tulemusi kiiresti saada, vaid tagab ka nende usaldusväärsuse.

Hind

Teine küsimus, mis patsiente sageli huvitab, on: kui palju maksab PCR-test? Tulenevalt meetodi uudsusest, kallite seadmete ostmise vajadusest on testi hind suhteliselt kõrge. PCR-i maksumust mõjutab infektsiooni tüüp, mille suhtes inimest testitakse. Testide eeldatav hind ja tingimused on järgmised:

1. STI-d kontrollitakse 1 päeva pärast, hind on 400-500 rubla.
2. Herpes, HPV, Epstein-Barri viirus, tsütomegloviirus tuvastatakse päevas, hind on 300-500 rubla.
3. Hepatiidi analüüs tehakse 5 päeva jooksul, kvalitatiivse variandi hind on 500 rubla, kvantitatiivse - 2000 rubla.
4. Helicobacter pylori tuvastatakse päevas, hind on 400 rubla.
5. Antigeenid, HIV-antikehad, hind - alates 380 rubla.
6. Kvalitatiivne analüüs HIV RNA, hind - alates 3500 rubla.
7. HIV RNA kvantitatiivne analüüs, hind - alates 11 000 rubla.

Video

Tähelepanu! Artiklis esitatud teave on ainult informatiivsel eesmärgil. Artikli materjalid ei nõua eneseravi. Ainult kvalifitseeritud arst saab teha diagnoosi ja anda soovitusi ravi kohta, lähtudes konkreetse patsiendi individuaalsetest omadustest.

Kas leidsite tekstist vea? Valige see, vajutage Ctrl + Enter ja me parandame selle!

Piisava ja tõhus ravi palju nakkushaigusedõigeaegne täpne diagnoos on vajalik. Selle probleemi lahendamisel on tänapäeval kaasatud kõrgtehnoloogilised molekulaarbioloogia meetoditel põhinevad diagnostikameetodid. Hetkel kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) juba laialdaselt praktilises meditsiinis kui kõige usaldusväärsemat laboratoorset diagnostikavahendit.

Mis seletab PCR-i populaarsust praegusel ajal?

Esiteks kasutatakse seda meetodit erinevate nakkushaiguste patogeenide suure täpsusega tuvastamiseks.

Teiseks jälgida ravi efektiivsust.

Erinevates käsiraamatutes, prospektides, artiklites, aga ka eriarstide selgitustes kohtame sageli arusaamatute terminite ja sõnade kasutamist. Kõrgtehnoloogilistest teadustoodetest on tõesti raske tavaliste sõnadega rääkida.

Mis on PCR-diagnostika olemus ja mehaanika?

Igal elusorganismil on oma ainulaadsed geenid. Geenid asuvad DNA molekulis, mis on tegelikult iga konkreetse organismi "visiitkaart". DNA (geneetiline materjal) on väga pikk molekul, mis koosneb ehitusplokkidest, mida nimetatakse nukleotiidideks. Iga nakkushaiguste patogeeni jaoks paiknevad need rangelt spetsiifiliselt, st teatud järjestuses ja kombinatsioonis. Kui on vaja aru saada, kas inimesel on konkreetne haigusetekitaja, võetakse bioloogiline materjal (veri, uriin, sülg, määrdumine), mis sisaldab mikroobi DNA-d või DNA fragmente. Kuid patogeeni geneetilise materjali kogus on väga väike ja on võimatu öelda, millisesse mikroorganismisse see kuulub. Selle probleemi lahendamiseks kasutatakse PCR-i. Polümeraasi ahelreaktsiooni olemus seisneb selles, et uurimiseks võetakse vähe DNA-d sisaldavat materjali ning PCR protsessi käigus suureneb konkreetsele patogeenile kuuluva geneetilise materjali hulk ning seeläbi on võimalik seda tuvastada.

PCR diagnostika on biomaterjali geneetiline uuring.

PCR-meetodi idee kuulub Ameerika teadlasele K. Mullinsile, mille ta pakkus välja 1983. aastal. Samas lai kliiniline rakendus saadi alles XX sajandi 90ndate keskel.

Tegeleme terminoloogiaga, mis see on - DNA jne. Iga elusolendi (loom, taim, inimene, bakter, viirus) rakul on kromosoomid. Kromosoomid on geneetilise teabe hoidjad, mis sisaldavad iga konkreetse elusolendi kogu geenide järjestust.

Iga kromosoom koosneb kahest DNA ahelast, mis on üksteise suhtes keerdunud spiraaliks. DNA on keemiliselt desoksüribonukleiinhape, mis koosneb struktuurikomponentidest – nukleotiididest. Nukleotiide on 5 tüüpi – tümiin (T), adenosiin (A), guaniin (G), tsütosiin (C) ja uratsiil (U). Nukleotiidid paiknevad üksteise järel ranges individuaalses järjestuses, moodustades geene. Üks geen võib koosneda 20-200 sellisest nukleotiidist. Näiteks insuliini tootmist kodeeriv geen on 60 aluspaari pikkune.

Nukleotiididel on komplementaarsuse omadus. See tähendab, et DNA ühes ahelas on adeniini vastas (A) alati teises ahelas tümiin (T) ja guaniin (G) vastas - tsütosiin (C). Skemaatiliselt näeb see välja selline:
G-C
T-A
A-T
See komplementaarsuse omadus on PCR jaoks võtmetähtsusega.

Lisaks DNA-le on RNA-l sama struktuur – ribonukleiinhape, mis erineb DNA-st selle poolest, et kasutab tümiini asemel uratsiili. RNA - on geneetilise teabe hoidja mõnedes viirustes, mida nimetatakse retroviirusteks (näiteks HIV).

DNA ja RNA molekulid võivad "paljuneda" (seda omadust kasutatakse PCR jaoks). See toimub järgmiselt: kaks DNA või RNA ahelat eemalduvad teineteisest külgedele, igal niidil istub spetsiaalne ensüüm, mis sünteesib uue ahela. Süntees toimub vastavalt komplementaarsuse põhimõttele, see tähendab, et kui nukleotiid A on algses DNA ahelas, siis T on äsja sünteesitud ahelas, kui G - siis C jne. See eriline "ehitaja" ensüüm vajab sünteesi alustamiseks "seemnet" - 5-15 nukleotiidist koosnevat järjestust. See "seeme" on määratletud iga geeni jaoks (klamüüdia geen, mükoplasma, viirused) katseliselt.

Seega koosneb iga PCR-tsükkel kolmest etapist. Esimeses etapis toimub DNA nn lahtikerimine – see tähendab kahe omavahel ühendatud DNA ahela eraldumine. Teises on "seeme" kinnitatud DNA ahela osa külge. Ja lõpuks nende DNA ahelate pikenemine, mida toodab "ehitaja" ensüüm. Praegu toimub kogu see keeruline protsess ühes katseklaasis ja koosneb korduvatest DNA reprodutseerimise tsüklitest, mida määratakse, et saada suur hulk koopiad, mida saab seejärel tuvastada tavapäraste meetoditega. See tähendab, et ühest DNA ahelast saame sadu või tuhandeid.

PCR-uuringu etapid

Bioloogilise materjali kogumine uurimistööks

Proovina kasutatakse erinevaid bioloogilisi materjale: veri ja selle komponendid, uriin, sülg, limaskestade eritised, tserebrospinaalvedelik, eritis haavapindadest, kehaõõnsuste sisu. Kõik bioproovid kogutakse ühekordselt kasutatavate instrumentidega ja kogutud materjal asetatakse steriilsetesse plasttorudesse või asetatakse söötmele, millele järgneb transport laborisse.

Võetud proovidele lisatakse vajalikud reaktiivid ja asetatakse programmeeritavasse termostaati - termotsüklerisse (võimendisse). Tsükleris korratakse PCR-i tsüklit 30-50 korda, mis koosneb kolmest etapist (denatureerimine, lõõmutamine ja elongatsioon). Mida see tähendab? Vaatleme üksikasjalikumalt.

Vahetu PCR reaktsiooni etapid, geneetilise materjali kopeerimine

IPCR etapp – geneetilise materjali ettevalmistamine kopeerimiseks.
Tekib temperatuuril 95 ° C, samal ajal kui DNA ahelad on lahti ühendatud ja "seemned" võivad neile istuda.

"Seemneid" toodavad tööstuslikult erinevad teadus- ja tootmisühingud ning laborid ostavad valmis. Samas näiteks klamüüdia tuvastamise “seeme” töötab ainult klamüüdia jne puhul. Seega, kui biomaterjali testitakse klamüüdiainfektsiooni esinemise suhtes, asetatakse reaktsioonisegusse klamüüdia "seeme"; kui testitakse biomaterjali Epstein-Barri viiruse suhtes, siis Epstein-Barri viiruse "seeme".

IIetapp – nakkustekitaja ja "seemne" geneetilise materjali ühendamine.
Kui on vaja määrata viiruse või bakteri DNA-d, asub "seeme" sellel DNA-l. See praimeri lisamise protsess on PCR-i teine ​​etapp. See etapp toimub temperatuuril 75 °C.

IIIetapp – nakkustekitaja geneetilise materjali kopeerimine.
See on geneetilise materjali tegelik pikenemise või paljunemise protsess, mis toimub temperatuuril 72 °C. Ensüümi ehitaja läheneb "seemnetele" ja sünteesib uue DNA ahela. Uue DNA ahela sünteesi lõppedes lõpeb ka PCR tsükkel. See tähendab, et ühes PCR-tsüklis kahekordistub geneetilise materjali hulk. Näiteks esialgses proovis oli 100 viiruse DNA molekuli, pärast esimest PCR tsüklit on proovis juba 200 testitava viiruse DNA molekuli. Üks tsükkel kestab 2-3 minutit.

Selleks, et genereerida identifitseerimiseks piisavalt geneetilist materjali, tehakse tavaliselt 30-50 PCR tsüklit, mis võtab aega 2-3 tundi.

Paljundatud geneetilise materjali tuvastamise etapp

PCR ise lõpeb siin ja siis tuleb sama oluline identifitseerimise etapp. Identifitseerimiseks kasutatakse elektroforeesi või märgistatud "seemneid". Elektroforeesi kasutamisel eraldatakse saadud DNA ahelad suuruse järgi ja erineva pikkusega DNA fragmentide olemasolu näitab positiivne tulemus analüüs (see tähendab konkreetse viiruse, bakterite jne olemasolu). Märgistatud "seemnete" kasutamisel lisatakse reaktsiooni lõpp-produktile kromogeen (värv), mille tulemusena kaasneb ensümaatilise reaktsiooniga värvuse teke. Värvuse tekkimine näitab otseselt, et algproovis on viirus või mõni muu tuvastatav aine.

Tänapäeval on võimalik märgistatud "seemneid" ja ka vastavat tarkvara kasutades PCR tulemusi kohe "lugeda". See on nn reaalajas PCR.

Miks on PCR-diagnostika nii väärtuslik?

PCR-meetodi üks olulisi eeliseid on selle kõrge tundlikkus - 95-100%. Need eelised peavad aga põhinema järgmiste tingimuste vältimatul järgimisel:

1. õige proovide võtmine, bioloogilise materjali transport;
2. steriilsete, ühekordselt kasutatavate instrumentide, spetsiaalsete laborite ja koolitatud personali kättesaadavus;
3. metoodika ja steriilsuse range järgimine analüüsi ajal

Tundlikkus on erinevate tuvastatud mikroobide puhul erinev. Nii on näiteks C-hepatiidi viiruse tuvastamise PCR-meetodi tundlikkus 97–98%, ureaplasma tuvastamise tundlikkus on 99–100%.

PCR-analüüsile omased võimalused võimaldavad teil saavutada ületamatu analüütilise spetsiifilisuse. See tähendab, et tuvastatakse täpselt otsitud mikroorganism, mitte sarnane või lähedalt seotud.
PCR-meetodi diagnostiline tundlikkus ja spetsiifilisus ületab sageli kultiveerimismeetodi omasid, mida nimetatakse nakkushaiguste tuvastamise "kuldstandardiks". Arvestades kultuuri kasvu kestust (mitu päeva kuni mitu nädalat), ilmneb PCR-meetodi eelis.

PCR infektsioonide diagnoosimisel
PCR-meetodi eelised (tundlikkus ja spetsiifilisus) määravad tänapäeva meditsiinis laia kasutusala.
PCR-diagnostika peamised rakendusvaldkonnad:

1. erineva lokaliseerimisega ägedate ja krooniliste nakkushaiguste diagnoosimine
2. ravi efektiivsuse jälgimine
3. patogeeni tüübi selgitamine

PCR-i kasutatakse sünnitusabis, günekoloogias, neonatoloogias, pediaatrias, uroloogias, venereoloogias, nefroloogias, nakkushaiguste kliinikus, oftalmoloogias, neuroloogias, ftisiopulmonoloogias jne.

PCR-diagnostika kasutamine toimub koos teiste uurimismeetoditega (ELISA, PIF, RIF jne). Nende kombinatsiooni ja otstarbekuse määrab raviarst.

PCR abil tuvastatud nakkusetekitajad

Viirused:

1. HIV-1 ja HIV-2 retroviirused
2. herpetiformsed viirused
3. herpes simplex viiruse tüübid 1 ja 2

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)- on biokeemilise tehnoloogia meetod molekulaarbioloogias, mida viiakse läbi eesmärgiga suurendada ühte või mitut DNA fragmentide koopiat mitme kraadi võrra, mis võimaldab teil luua konkreetsest DNA järjestusest mitmest tuhandest miljonini koopiaid.

Cary Mullise poolt 1983. aastal välja töötatud PCR-meetod on nüüdseks levinud ja sageli asendamatu meetod, mida kasutatakse meditsiini- ja bioloogiliste uuringute laborites paljude erinevate rakenduste jaoks. Nende hulka kuuluvad DNA kloonimine sekveneerimiseks, DNA-põhine fülogenees või geenide funktsionaalne analüüs; diagnostika pärilikud haigused; geneetiliste sõrmejälgede tuvastamine (kasutatakse kohtuekspertiisi valdkondades ja isaduse tuvastamisel), samuti nakkushaiguste avastamine ja diagnoosimine. 1993. aastal pälvis Mullis koos Michael Smithiga PCR-alase töö eest Nobeli keemiaauhinna.

Meetod põhineb termilisel tsüklil, mis koosneb korduvatest kuumutamis- ja jahutamisreaktsioonide tsüklitest DNA denatureerimiseks ja replikatsiooniks ensüümide abil. Praimerid (lühikesed DNA tükid), mis sisaldavad järjestusi, mis on sihtkohaga komplementaarsed koos DNA polümeraasiga (mille järgi meetod on nimetatud), on selektiivse ja taasamplifikatsiooni juhtimise võtmekomponendid. PCR-protsessis kasutatakse sünteesitud DNA-d ennast replikatsiooni matriitsina, pannes käima ahelreaktsiooni, mille käigus matriitsi DNA amplifitseeritakse eksponentsiaalselt. PCR-i saab teostamiseks oluliselt muuta lai valik geneetiline manipuleerimine.

Peaaegu kõik PCR-rakendused kasutavad termostabiilset DNA polümeraasi, näiteks Taq polümeraasi, mis on algselt bakteritest eraldatud ensüüm. Thermusaquaticus. See DNA polümeraas paneb ensümaatiliselt DNA ehitusplokkidest - nukleotiididest - kokku uue DNA ahela, kasutades matriitsina üheahelalist DNA-d ja DNA oligonukleotiide (nimetatakse ka DNA praimeriteks), mida on vaja DNA sünteesi algatamiseks. Valdav enamus PCR-meetoditest kasutab termilist tsüklit, st PCR-proovi vahelduvat kuumutamist ja jahutamist teatud temperatuuriastmete seeria jooksul. Need termilise tsükli etapid on kõigepealt vajalikud DNA kaksikheeliksi kahe ahela füüsiliseks eraldamiseks kõrgel temperatuuril protsessis, mida nimetatakse DNA denatureerimiseks. Madalamal temperatuuril kasutatakse DNA polümeraasi DNA sünteesis iga ahelat matriitsina, et selektiivselt amplifitseerida sihtmärk-DNA piirkonda. PCR-i tulemuste selektiivsus, kasutades teatud termilise tsükli tingimustes amplifikatsiooniks sihtmärk-DNA piirkonnaga komplementaarseid praimereid.

PCR diagnostika põhimõtted

PCR-i kasutatakse DNA ahela spetsiifilise lõigu (sihtmärk-DNA) amplifitseerimiseks. Enamik PCR meetodeid amplifitseerivad tavaliselt DNA fragmente kuni ~ 10 000 aluspaari (kb), kuigi mõned meetodid võimaldavad fragmentide suurust suurendada kuni 40 kb. Reaktsiooni käigus saadakse piiratud kogus amplifitseeritud lõppprodukti, mida kontrollivad reaktsioonis saadaolevad reaktiivid ja reaktsiooniproduktide tagasiside pärssimine.

Põhiline PCR-komplekt nõuab mitmeid komponente ja reaktiive. Need sisaldavad:

• DNA matriit, mis sisaldab amplifitseeritavat sihtmärk-DNA piirkonda.
• kaks praimerit, komplementaarne sihtmärk-DNA iga senss- ja antisenss-ahela 3'-otstega.
• Taq polümeraas või mõni muu DNA polümeraas, mis töötab optimaalsel temperatuuril umbes 70 °C.
• Deoksünukleosiidtrifosfaadid(dNTP-d; nukleotiide sisaldavad trifosfaatrühmad), ehitusplokid, millest DNA polümeraas sünteesib uue DNA ahela.
• puhverlahus, pakkudes sobivad keemilised tingimused optimaalne tegevus ja DNA polümeraasi stabiilsus.
• kahevalentsed katioonid, magneesiumi- või mangaaniioonid; Tavaliselt kasutatakse Mg2+, kuid Mn2+ saab kasutada ka PCR-vahendatud DNA mutageneesiks, kuna Mn2+ kõrgemad kontsentratsioonid suurendavad DNA sünteesi ajal veamäära.
• Monovalentsed katioonid kaaliumiioonid.

PCR viiakse tavaliselt läbi reaktsioonimahuga 10-200 µl väikestes reaktsioonitorudes (maht 0,2-0,5 ml) termotsükleri-võimendis. Tsükler soojendab ja jahutab reaktsioonitorusid, et saavutada iga reaktsioonietapi jaoks vajalik temperatuur. Paljud kaasaegsed jalgrattasõidukid kasutavad Peltieri efekti, mis võimaldab PCR-toru komplekti soojendada ja jahutada lihtsalt elektrivoolu suunda muutes. Õhukeseseinalised reaktsioonitorud soodustavad soodsat soojusjuhtivust, et tagada kiire termiline tasakaal. Vanemad tsikliautod, millel pole soojendusega kaas, nõuavad reaktsioonisegu pinnale õlikihti või viaalis olevat vahatera.

Menetluse järjekord

Tavaliselt koosneb PCR 20–40 korduvast temperatuurimuutusest, mida nimetatakse tsükliteks, kusjuures iga tsükkel koosneb tavaliselt 2–3 diskreetsest temperatuuriastmest, tavaliselt kolmest. Jalgrattasõit algab ja lõpeb sageli ühe temperatuuriastmega (nn ootusärevus) kõrgel temperatuuril (> 90 °C) toote lõplikuks paisumiseks või lühikeseks ladustamiseks. Igas tsüklis kasutatavad temperatuurid ja nende kasutamise kestus sõltuvad paljudest parameetritest. Nende hulka kuuluvad DNA sünteesiks kasutatav ensüüm, kahevalentsete ioonide ja dNTP-de kontsentratsioon reaktsioonis ning praimerite sulamistemperatuur (Tm).

• Initsialiseerimise etapp: See etapp seisneb reaktsiooni kuumutamises temperatuurini 94-96 °C (või 98 °C, kui kasutatakse väga kuumakindlaid polümeraase), mis viiakse läbi 1-9 minutit. See samm on vajalik ainult DNA polümeraaside jaoks, mis nõuavad kuumuse aktiveerimist, nn kuumkäivitus-PCR.
• Denatureerimise etapp: See on esimene regulaarne termotsükli sündmus ja see seisneb reaktsiooni kuumutamises 20-30 sekundi jooksul temperatuurini 94–98 °C. See põhjustab DNA matriitsi lõhustamise koos komplementaarsete aluste vaheliste vesiniksidemete hävimisega ja üheahelaliste DNA molekulide moodustumisega.
• Lõõmutamise etapp: Reaktsioonitemperatuuri alandatakse 50-65 °C-ni 20-40 sekundiks, mis võimaldab praimeritel seonduda üheahelalise DNA matriitsiga. Tavaliselt on anniilimistemperatuur umbes 3-5 kraadi Celsiuse järgi madalam kui kasutatud praimerite Tm. Stabiilsed DNA-DNA vesiniksidemed moodustuvad ainult siis, kui praimeri järjestus ühtib rohkem järjestuse matriitsiga. Polümeraas seondub praimeri-matriitsi hübriidiga ja käivitab DNA sünteesi.
• Laienemise / pikenemise etapp: Selle etapi temperatuur sõltub kasutatavast DNA polümeraasist; Taq polümeraasi optimaalne aktiivsustemperatuur on 75-80 °C; selle ensüümi jaoks kasutatakse tavaliselt temperatuuri 72 °C. Selles etapis sünteesib DNA polümeraas uue DNA ahela, mis on komplementaarne DNA matriitsi ahelaga, lisades dNTP-sid, mis on matriitsiga komplementaarsed 5" kuni 3" suunas, ühendades dNTP 5" fosfaatrühma 3" -ga. hüdroksüülrühm tekkiva (paisuva) DNA lõpus. Laienemisaeg sõltub nii kasutatud DNA polümeraasist kui ka amplifitseeritava DNA fragmendi pikkusest. Tavaliselt polümeriseerub DNA polümeraas oma optimaalsel temperatuuril tuhat alust minutis. Optimaalsetes tingimustes, s.o. piiravatest substraatidest või reagentidest tingitud piirangute puudumisel kahekordistatakse igas laiendamisetapis sihtmärk-DNA kogust, mille tulemuseks on DNA fragmendi eksponentsiaalne (geomeetriline) amplifikatsioon.
• Lõplik laiendus: See on ainus samm, mida mõnikord tehakse temperatuuril 70–74 °C 5–15 minuti jooksul pärast viimast PCR-tsüklit, et tagada, et järelejäänud üheahelaline DNA on täielikult laienenud.
• Lõplik ootus: Seda etappi temperatuuril 4–15 °C saab lõputult kasutada reaktsiooni lühiajaliseks hoidmiseks. Kontrollimaks, kas PCR on sünteesinud oodatud DNA fragmendi (mida mõnikord nimetatakse ka "amplimeeriks" või "amplikoniks"), kasutatakse PCR produktide suuruse järgi eraldamiseks agaroosgeelelektroforeesi. PCR-produktide suurus määratakse kindlaks, võrreldes DNA redeli (molekulmassi markeriga), mis sisaldab teadaoleva suurusega DNA fragmente, mis viiakse läbi geelil koos PCR-produktidega.

Polümeraasi ahelreaktsiooni etapid

PCR protsessi võib jagada kolmeks etapiks:

1. Eksponentsiaalne võimendus: Iga tsükli jooksul kahekordistatakse toote kogust (eeldusel, et reaktsiooni efektiivsus on 100%). Reaktsioon on väga tundlik: vaja on vaid väikest kogust DNA-d.
2. Nivelleerimise etapp: reaktsioon aeglustub, kuna DNA polümeraas kaotab aktiivsuse ja reaktiivide, nagu dNTP-d ja praimerid, tarbimine muudab need piiravaks .
3. Platoo: Toode ei kogune enam reaktiivide ja ensüümide ammendumise tõttu.

PCR optimeerimine

Praktikas ei pruugi PCR olla edukas erinevatel põhjustel, eriti selle tundlikkuse tõttu saastumise suhtes, mis põhjustab DNA kõrvalsaaduste amplifikatsiooni. Sellega seoses on PCR tingimuste optimeerimiseks välja töötatud mitmeid tehnikaid ja protseduure. Võõra DNA saastumist käsitletakse laboriprotokollide ja protseduuride abil, mis puhastavad PCR-eelsed segud võimalikest DNA saasteainetest. Tavaliselt hõlmab see PCR-komplektide eraldamist PCR-toodete analüüsi- või puhastuspiirkondadest, ühekordselt kasutatavate plastriistade kasutamist ja tööpinna põhjalikku puhastamist reaktsioonietappide vahel. Praimerite kujundamise tehnikad mängivad olulist rolli PCR-produktide isoleerimise parandamisel ja kõrvalsaaduste tekke vältimisel ning alternatiivsete puhverkomponentide või polümeraasi ensüümide kasutamine võib aidata amplifitseerida pikki või muul viisil probleemseid DNA piirkondi. Reaktiivide, nagu formamiid, lisamine puhversüsteemidesse võib suurendada PCR-i spetsiifilisust ja taastumist. Praimerite kavandamisel võib abistada teoreetiliste PCR-tulemuste arvutisimulatsiooni (elektrooniline PCR).

PCR rakendamine

DNA selektiivne isoleerimine

PCR võimaldab eraldada DNA fragmente genoomsest DNA-st spetsiifilise DNA piirkonna selektiivse amplifikatsiooni teel. See PCR-i rakendus täiendab paljusid meetodeid, näiteks hübridisatsioonisondide loomist Southern või Northern blot analüüsi ja DNA kloonimise meetodite jaoks, mis nõuavad suures koguses DNA-d, mis esindavad DNA spetsiifilist piirkonda. PCR tagab nendele meetoditele suure puhta DNA sisalduse, mis võimaldab analüüsida DNA proove isegi väikese koguse lähteainega.

Teised PCR-i rakendused hõlmavad DNA sekveneerimist tundmatute PCR-i abil amplifitseeritud järjestuste tuvastamiseks, milles ühte amplifikatsioonipraimerit saab kasutada Sangeri sekveneerimisel, DNA järjestuse eraldamist rekombinantse DNA tehnoloogiate kiirendamiseks, mis hõlmavad DNA järjestuse sisestamist plasmiidi või geneetilisse materjali. teisest organismist. Bakterite (E. coli) kolooniaid saab PCR-iga kiiresti skriinida, et korrigeerida vektori DNA kujundust. PCR-i saab kasutada ka geneetilise sõrmejälgede võtmiseks; kohtumeditsiinis kasutatav tehnika isiku või organismi tuvastamiseks eksperimentaalse DNA võrdlemise teel erinevate PCR meetodite abil.

Mõnedel "sõrmejälgede" PCR-meetoditel on suur diskrimineeriv jõud ja neid saab kasutada indiviidide, näiteks vanema ja lapse või õdede-vendade vaheliste geneetiliste suhete määramiseks, ning neid kasutatakse isaduse testimisel. Seda tehnikat saab rakendada ka organismide vaheliste evolutsiooniliste suhete määramiseks.

DNA amplifikatsioon ja kvantifitseerimine

Kuna PCR suurendab sihtmärk-DNA piirkondade koopiate arvu, saab PCR-i kasutada väga väikeste proovikoguste analüüsimiseks. See on sageli kriitilise tähtsusega kohtuekspertiisi uurimisel, kus tõenditena on saadaval ainult mikrokogused DNA-st. PCR-i saab kasutada ka kümnete tuhandete aastate vanuse iidse DNA analüüsimiseks. Neid PCR-meetodeid on edukalt kasutatud loomadel, nagu 40 000-aastane mammut, aga ka inimese DNA-l, alates Egiptuse muumiate analüüsist kuni Vene tsaari tuvastamiseni.

Kvantitatiivsed PCR meetodid hindavad proovis esineva antud järjestuse kogust – meetodit kasutatakse sageli geeniekspressiooni taseme kvantifitseerimiseks. Reaalajas PCR on väljakujunenud DNA kvantifitseerimise tööriist, mis mõõdab produkti DNA kogunemist pärast iga PCR amplifikatsiooni tsüklit.

PCR haiguste diagnoosimisel

PCR võimaldab varakult diagnoosida pahaloomulisi haigusi, nagu leukeemia ja lümfoom, mis on praegu vähiuuringutes kõrgelt arenenud ja mida juba rutiinselt kasutatakse. PCR-i saab läbi viia otse genoomse DNA proovidega, et tuvastada translokatsioonispetsiifilisi omadusi pahaloomulised rakud mille tundlikkus on vähemalt 10 000 korda kõrgem kui teistel meetoditel.

PCR võimaldab tuvastada ka kultiveerimata või aeglaselt kasvavaid organisme, nagu mükobakterid, anaeroobsed bakterid ja viirused koekultuuride ja loommudelite põhjal. Mikrobioloogia valdkonna PCR-diagnostika rakenduste aluseks on nakkusetekitajate tuvastamine ja mittepatogeensete tüvede eristamine patogeensetest spetsiifiliste geenide tõttu.

Viiruse DNA-d saab tuvastada ka PCR abil. Praimerid peavad olema spetsiifilised viiruse sihtmärk-DNA järjestuste suhtes ja PCR-i saab kasutada diagnostiliseks DNA testiks või viiruse genoomi järjestamiseks. PCR kõrge tundlikkus võimaldab tuvastada viirusi varsti pärast nakatumist ja isegi enne haiguse algust. Viiruse varajane avastamine võib anda arstidele olulisi ravivõimalusi. Viiruse kogust ("viiruskoormust") patsiendis saab määrata ka kvantitatiivse PCR-põhise DNA analüüsiga.

Polümeraasi ahelreaktsiooni põhimeetodite variatsioonid

• Alleelispetsiifiline PCR: ühe nukleotiidi polümorfismil (SNP) põhinev diagnostiline või kloonimismeetod (DNA ühe aluse erinevused). Nõuab eelnevaid teadmisi DNA järjestuse, sealhulgas alleelide erinevuste kohta ja kasutab praimereid, mille 3' otsad ulatuvad üle SNP-de. Range PCR amplifikatsioon on palju vähem efektiivne matriitsi ja praimeri mittevastavuse korral, seega on amplifikatsioon SNP-spetsiifilisega edukas praimeri signaalid spetsiifiliste SNP-de olemasolu kohta järjestuses.
• PCR koost või polümeraasi tsüklikoost (PCP): pikkade DNA järjestuste kunstlik süntees PCR abil lühikeste kattuvate segmentidega pikkade oligonukleotiidide kogumil. Oligonukleotiidides vahelduvad senss- ja antisenss-ahela suunad ning kattuvad segmendid määravad PCR fragmentide järjestuse, genereerides selektiivselt lõpliku pika DNA produkti.
• Asümmeetriline PCR: amplifitseerib eelistatavalt ühte DNA ahelat kaheahelalises DNA matriitsis. Kasutatakse sekveneerimisel ja hübridisatsioonisondeerimisel, kus on vaja kahest komplementaarsest ahelast ainult ühe amplifitseerimist. PCR viiakse läbi nagu tavaliselt, kuid amplifikatsiooniks mõeldud ahela jaoks on palju praimereid. Aeglase (aritmeetilise progresseerumisega) amplifikatsiooni tõttu reaktsiooni lõpus pärast piirava praimeri kasutamist on vaja täiendavaid PCR-tsükleid. Selle protsessi uusim modifikatsioon, tuntud kui "LATE-PCR" (lineaarsus pärast eksponentsiaalset faasi - PCR), kasutab reaktsiooni efektiivsuse säilitamiseks piiravat praimerit, mille sulamistemperatuur (Tm) on kõrgem kui praimeri liig, kuna piirava praimeri kontsentratsioon väheneb. reaktsiooni keskel.
• Väljahelistatav PCR: väga paralleelne meetod täpsete DNA molekulide saamiseks geenisünteesi jaoks. DNA molekulide keerulist kogumit modifitseerivad ainulaadsed külgmised märgised massiliseks paralleelseks sekveneerimiseks. Märgisele suunatud praimerid annavad seejärel PCR abil järjestatud molekulid.
• Helikaasist sõltuv võimendus: sarnane traditsioonilisele PCR-ile, kuid nõuab konstantset temperatuuri kui denatureerimis- ja anniilimis-/paisumistsüklite läbimine. Kuumuse denatureerimise asemel kasutatakse DNA helikaasi, DNA-d lahti kerivat ensüümi.
• Kuumkäivituse PCR: tehnika, mis vähendab mittespetsiifilist amplifikatsiooni PCR-i etappide esialgse seadistamise ajal. Seda saab teha käsitsi, kuumutades reaktsioonikomponendid enne polümeraasi lisamist denatureerimistemperatuurini (nt 95 °C). On välja töötatud spetsiaalsed ensüümsüsteemid, mis inhibeerivad polümeraasi aktiivsust toatemperatuuril kas antikehade sidumise või kovalentselt seotud inhibiitorite juuresolekul, mis dissotsieeruvad alles pärast kõrge temperatuuriga aktiveerimisetappi. Kuumkäivituse/külmviimistlusega PCR saavutatakse uudsete hübriidpolümeraasidega, mis on toatemperatuuril inaktiivsed ja aktiveeruvad koheselt pikenemistemperatuuril.
• Mikrosatelliitidevahelise järjestuse spetsiifiline PCR (ISSR): PCR DNA sõrmejälgede võtmise meetod, mis suurendab piirkondade koopiate arvu lihtsate kordusjärjestuste vahel, et saada kordumatu sõrmejälg amplifitseeritud fragmendi pikkusest.
• Tagurpidi PCR kasutatakse laialdaselt genoomsete insertide ümber asuvate järjestuspiirkondade määratlemiseks. See hõlmab DNA lõhustamise ja eneseligatsiooni seeriat, mille tulemuseks on teadaolevad järjestused tundmatu järjestuse mõlemas otsas.
• PCR, mida vahendab ligeerimine: Kasutab huvipakkuva DNA-ga seotud väikeseid DNA linkereid ja mõnda DNA linkeritega seotud praimerit; kasutatakse DNA sekveneerimiseks, genoomi kõndimiseks ja DNA jalajälje võtmiseks.
• Metülatsioonispetsiifiline PCR(MSP): Stephen Bailini ja Jim Hermani poolt Johns Hopkinsi meditsiinikoolis välja töötatud seda kasutatakse CpG saarte metüülimise tuvastamiseks genoomses DNA-s. DNA-d töödeldakse esmalt naatriumvesiniksulfitiga, mis muudab metüleerimata tsütosiini alused uratsiiliks, mille PCR praimerid tunnevad ära tümiinina. Seejärel viiakse modifitseeritud DNA-ga läbi kaks PCR-i, kasutades identsete praimerite komplekte, välja arvatud mis tahes CpG saareke praimeri järjestuses. Nendes punktides tunneb üks praimerite komplekt DNA ära tsütosiinidega, et suurendada metüleeritud DNA koopiate arvu, ja üks komplekt tunneb DNA ära uratsiili või tümiiniga, et amplifitseerida metüleerimata DNA. MSP-d, kasutades qPCR-i, saab läbi viia ka kvantitatiivse, mitte kvalitatiivse teabe saamiseks metüülimise kohta.
• Minipraimer - PCR: kasutatakse termostabiilseid polümeraase (S-Tbr), mis võivad ulatuda lühikestest praimeritest ("smalligos"), millel on 9 või 10 nukleotiidi arv. See meetod võimaldab PCR-iga sihtida väiksemate praimeritega seotud piirkondi ja seda kasutatakse konserveerunud DNA järjestuste, näiteks 16S (või eukarüootse 18S) rRNA geeni amplifitseerimiseks.
• Mitmekordsest ligeerimisest sõltuv sondi amplifikatsioon (MLPA): võimaldab mitme sihtmärgi amplifitseerimist ainult ühe praimerite paariga, vältides seega multipleks-PCR-i eraldusvõime piiranguid.
• Multiplex PCR koosneb mitmest praimerite komplektist ühes PCR segus, et saada erineva suurusega amplikonid, mis on spetsiifilised erinevatele DNA järjestustele. Keskendudes korraga mitmele geenile, on ühe testi käigus võimalik saada lisainfot, mille sooritamiseks kuluks muidu kordades rohkem reaktiive ja rohkem aega. Iga praimerite komplekti anniilimistemperatuurid peavad olema optimeeritud, et need toimiksid õigesti ühe reaktsiooni jooksul ja amplikoni suurustega. See tähendab, et nende aluspaari pikkus peab olema piisavalt erinev, et moodustada geelelektroforeesiga visualiseerituna erinevad ribad.
• Pesastatud PCR: suurendab DNA amplifikatsiooni spetsiifilisust, vähendades tausta mittespetsiifilise DNA amplifikatsiooni tõttu. Kahes järjestikuses PCR-is kasutatakse kahte praimerite komplekti. Esimeses reaktsioonis kasutatakse DNA produktide sünteesimiseks ühte paari praimereid, mis lisaks ettenähtud eesmärgile võivad siiski koosneda mittespetsiifiliselt amplifitseeritud DNA fragmentidest. Seejärel kasutatakse tooteid teises PCR-is praimerite komplektiga, mille seondumissaidid erinevad täielikult või osaliselt iga esimeses reaktsioonis kasutatud praimeri 3'-otstest Pesastatud PCR on pikkade DNA fragmentide spetsiifilisel amplifitseerimisel sageli edukam kui traditsiooniline PCR, kuid see nõuab täpsemaid teadmisi sihtjärjestuste kohta.
• PCR kattuvate pikendustega või splaissimine kattuvate pikendustega(SOE): geenitehnoloogia tehnika, mida kasutatakse kahe või enama komplementaarseid järjestusi sisaldava DNA tüki ühendamiseks. Kasutatakse järjestusi või mutatsioone reguleerivaid geene sisaldavate DNA tükkide ühendamiseks; tehnika võimaldab luua spetsiifilisi ja pikki DNA konstruktsioone.
• Kvantitatiivne PCR (QPCR): kasutatakse PCR produkti koguse mõõtmiseks (tavaliselt reaalajas). Kvantifitseerib DNA, cDNA või RNA esialgsed kogused. qPCR-i kasutatakse laialdaselt DNA järjestuse olemasolu proovis ja selle koopiaarvu määramiseks proovis. Reaalajas kvantitatiivne PCR on väga suure täpsusega. QRT-PCR (või QF-PCR) meetodid kasutavad fluorestseeruvaid värvaineid nagu Sybr Green, EvaGreen või fluorofoori sisaldavaid DNA sonde, nagu TaqMan, et mõõta amplifitseeritud produkti kogust reaalajas. Mõnikord nimetatakse seda RT-PCR (reaalaja PCR) või RQ-PCR. QRT-PCR või RTQ-PCR on sobivamad lühendid, kuna RT-PCR viitab tavaliselt pöördtranskriptsiooni PCR-ile, mida sageli kasutatakse koos qPCR-iga.
• Pöördtranskriptsiooni PCR (RT-PCR): suurendada DNA koopiate arvu RNA-st. Pöördtranskriptaas transkribeerib RNA cDNA-ks, mida seejärel amplifitseeritakse PCR abil. RT-PCR-i kasutatakse laialdaselt ekspressiooniprofiilide koostamisel, et tuvastada geeniekspressiooni või määrata RNA transkripti järjestust, sealhulgas transkriptsiooni algus- ja lõppsaite. Kui geeni genoomne DNA järjestus on teada, saab RT-PCR abil kaardistada eksonite ja intronite asukoha geenis. Geeni 5'-ots (mis vastab transkriptsiooni alguskohale) määratakse tavaliselt RACE-PCR-ga (cDNA otste kiire amplifikatsioon).
• tahke faasi PCR: hõlmab mitmeid tähendusi, sealhulgas "Polonia Amplification" (kus kolooniate PCR tehakse näiteks geelmaatriksil), "Bridge PCR" (praimerid on kovalentselt seotud tahke tugipinnaga), traditsiooniline tahke faasi PCR (kus "asümmeetriline" PCR" kasutatakse praimerite juuresolekul, mis kannavad tahket kandjat, mille järjestus vastab ühele vesipraimeritest) ja tugevdatud tahke faasi PCR-i (kus tavalist tahke faasi PCR-i saab parandada, kasutades kõrge Tm-ga ja pesastatud tahke kandja praimereid koos võimalus rakendada termilist "sammu", et soodustada kruntvärvide moodustumist kindla toega).
• Termiline asümmeetriline interleaved PCR (TAIL-PCR): kasutatakse teadaolevale järjestusele järgneva tundmatu järjestuse eraldamiseks. Tuntud järjestuses kasutab TAIL-PCR erineva anniilimistemperatuuriga pesastatud praimerite paari; praimerit degeneraat kasutatakse amplifitseerimiseks tundmatust järjestusest erinevas suunas.
• Touchdown PCR (Step PCR): PCR variant, mille eesmärk on vähendada mittespetsiifilist tausta, alandades järk-järgult anniilimistemperatuuri PCR tsüklite edenedes. Algtsüklite lõõmutamistemperatuur on tavaliselt paar kraadi (3–5 °C) kõrgem kasutatud praimerite Tm-st, samas kui hilisemates tsüklites on temperatuur paar kraadi (3–5 °C) madalam kui praimerite Tm. praimerid. Kõrgemad temperatuurid annavad praimeri sidumisel spetsiifilisema ja madalamad temperatuurid võimaldavad esialgsete tsüklite jooksul tekkinud spetsiifiliste saaduste tõhusamat amplifikatsiooni.
• PAN-AC: Kasutab võimendamiseks isotermilisi tingimusi ja seda saab rakendada elusrakkudele.
• Universaalne kiire jalutuskäik läbi genoomi: genoomiskõnni ja geneetilise sõrmejälgede võtmiseks, kasutades spetsiifilisemat "kahepoolset" PCR-i kui traditsioonilisi "ühepoolseid" lähenemisviise (kasutades ainult ühte geenispetsiifilist praimerit ja üht tavalist praimerit – mis võib mehhanismi tõttu põhjustada kunstlikku "müra"). , sealhulgas lassostruktuuri moodustamine. UFW lihtsustatud derivaadid on "Lane RAGE" (lasso-pesastatud PCR genoomse DNA otste kiireks amplifitseerimiseks), "5" RACE Lane ja "3" RACE Lane.
• sissesilicoPCR(digitaalne PCR, virtuaalne PCR, e-PCR, e-PCR) viitab arvutusvahenditele, mida kasutatakse teoreetilise polümeraasi ahelreaktsiooni tulemuste arvutamiseks, kasutades etteantud praimerite komplekti (sonde), et amplifitseerida järjestatud genoomist või transkriptoomist pärinevaid DNA järjestusi.

PCR ajalugu

1971. aasta Journal of Molecular Biology artiklis kirjeldasid Kleppe jt esimest korda meetodit, mis kasutas ensümaatilist analüüsi lühikese DNA matriitsi replitseerimiseks praimeritega in vitro tingimustes. See PCR-i põhiprintsiibi varajane ilming ei pälvinud aga erilist tähelepanu ja polümeraasi ahelreaktsiooni leiutamine 1983. aastal omistatakse üldiselt Carey Mullisele.

Kui Mullis 1983. aastal PCR-i välja töötas, töötas ta Californias Emeryville'is varajase biotehnoloogiaettevõtte Cetus Corporationi heaks. Seal vastutas ta lühikeste DNA ahelate sünteesi eest. Mullis kirjutas, et ta eostas PCR-i ühel õhtul oma autos mööda Vaikse ookeani ranniku maanteed sõites. Ta mängis mõttes uut viisi DNA muutuste (mutatsioonide) analüüsimiseks, kui mõistis, et ta oli selle asemel leiutanud meetodi DNA mis tahes lõigu koopiate arvu suurendamiseks DNA polümeraasi poolt põhjustatud korduvate dubleerimistsüklite kaudu. Ajakirjas Scientific American võttis Mullis protseduuri kokku: „Alates ühest DNA geneetilise materjali molekulist, suudab PCR genereerida ühe päevaga 100 miljardit sellist molekuli. Seda reaktsiooni on lihtne läbi viia. See ei nõua rohkem kui katseklaasi, mõnda lihtsat reaktiivi ja soojusallikat. 1993. aastal pälvis ta oma leiutise eest Nobeli keemiaauhinna, seitse aastat hiljem, kui ta ja ta kolleegid Cetuses oma ettepaneku esimest korda ellu viisid. Siiski on mõningaid vaidlusi teiste teadlaste intellektuaalse ja praktilise panuse üle Mullise töösse ning selle üle, kas ta oli PCR-printsiibi ainus leiutaja.

PCR-meetod põhineb sobiva DNA polümeraasi kasutamisel, mis on võimeline taluma kõrgeid temperatuure >90 °C (194 °F), mis on vajalikud DNA kahe ahela lõhustamiseks DNA kaksikheeliksis pärast iga replikatsioonitsüklit. Algselt in vitro katseteks kasutatud DNA polümeraasid, mida ennustas PCR, ei talunud nii kõrgeid temperatuure. Seetõttu olid varased DNA replikatsiooniprotseduurid väga ebaefektiivsed ja aeganõudvad ning nõudsid suures koguses DNA polümeraasi ja pidevat töötlemist kogu protsessi vältel.

1976. aastal avastati termofiilsest bakterist eraldatud DNA polümeraas Taq. Thermusaquaticus, mis elab loomulikult kuumas (50–80 °C (122–176 °F)) keskkondades, näiteks kuumaveeallikates, sillutas teed PCR-meetodi järsule täiustamisele. DNA polümeraas isoleeritud T.Aquaticus, on kõrgetel temperatuuridel stabiilne ja jääb aktiivseks ka pärast DNA denatureerimist, välistades seega vajaduse lisada pärast iga tsüklit uusi DNA polümeraase. See võimaldas termotsükleril põhineva DNA amplifikatsiooni protsessi automatiseerida.

Patendisõjad

Kavandatava PCR-meetodi patenteeris Carey Mullis ja see on omistatud Cetus Corporationile, kus Mullis töötas, kui ta 1983. aastal selle tehnika leiutas. Taq polümeraasi ensüüm on samuti kaitstud patentidega. Metoodikaga on seotud mitmeid kõrgetasemelisi kohtuasju, sealhulgas DuPonti poolt esitatud ebaõnnestunud kohtuasi. Farmaatsiaettevõte Hoffmann-La Roche omandas patentide õigused 1992. aastal ja praegu on nende valduses need, mis on siiani kaitstud.

Sarnane patendivõitlus Taq polümeraasi ensüümi üle käib endiselt mõnes jurisdiktsioonis üle maailma Roche ja Promega vahel. Juriidilised argumendid läksid kaugemale 28. märtsil 2005 aegunud PCR-i ja Taqi polümeraasi esialgsete patentide tingimustest.

Sageli kasutatakse kiire meetodina viiruste näitamiseks ja tuvastamiseks.

Selle meetodi töötas esmakordselt välja C. Mullis (USA) 1983. aastal. Tänu oma kõrgele tundlikkusele, spetsiifilisusele ja hõlpsasti rakendatavale kasutamisele kasutatakse seda laialdaselt geneetikas, kohtumeditsiinis, diagnostikas ja muudes valdkondades.

Meetodi olemus on amplifikatsioon, st DNA molekuli rangelt määratletud fragmentide koopiate arvu suurendamine in vitro. Selle meetodi puhul toimib maatriksmehhanism ja komplementaarsuse põhimõte. Kaks üksikut polünukleotiidahelat (nukleiinhapped) on võimelised vesiniksideme moodustama üheks kaheahelaliseks ahelaks, kui ühe nukleotiidjärjestused kattuvad täpselt teise nukleotiidjärjestusega, nii et nende lämmastikualused võivad moodustada adeniini-tüümiini ja guaniin-tsütosiini paare.

PCR põhineb DNA amplifikatsioonil, kasutades termostabiilset DNA polümeraasi, mis sünteesib vastastikku komplementaarseid DNA ahelaid, alustades kahest praimerist. Praimer on DNA tükk, mis koosneb 20-30 nukleotiidist. Need praimerid (praimerid) on komplementaarsed DNA vastasahelatega. DNA sünteesi käigus sisestatakse praimerid äsja sünteesitud DNA molekulide ahelasse.

Tavaliselt määratakse PCR 25-40 tsüklina. Iga tsükkel sisaldab kolme etappi: esimene on denatureerimine 92–95 °C juures. Sel juhul kaks DNA ahelat lahknevad; teine ​​- lõõmutamine või praimerite lisamine temperatuuril 50-65 ° C; kolmas on pikenemine ehk polümerisatsioon temperatuuril 68–72 °C, samas kui DNA polümeraas viib läbi DNA matriitsi ahelate komplementaarse lõpetamise, kasutades nelja tüüpi nukleotiide. Ühe tsükli tulemusena kahekordistub soovitud geneetiline materjal. Esimeses tsüklis moodustunud DNA ahelad toimivad matriitsina teise tsükli jaoks jne. Pärast esimest tsüklit amplifitseeritakse ainult kahe praimeri vaheline fragment. Seega kahekordistub amplifitseeritud piirkonna koopiate arv, mis võimaldab sünteesida miljoneid (2 n) DNA fragmente 25-40 tsükliga – piisav kogus, et neid erinevate meetoditega (sisaldavad hübridisatsioonisondid) näidata. teatud silt, elektroforees jne) . Sagedamini kasutatakse selleks agaroosgeeli elektroforeesi etiidiumbromiidiga värvimisega.

PCR-is kasutatakse praimereid patogeeni DNA osadest, millel on ainulaadne nukleotiidjärjestus, mis on iseloomulik ainult konkreetsele patogeenile.

PCR seadistamise meetod on järgmine: uuritavast materjalist eraldatakse DNA matriits; eraldatud DNA kombineeritakse katseklaasis amplifikatsiooniseguga, mis sisaldab DNA polümeraasi, kõiki 4 tüüpi nukleotiide, 2 tüüpi praimereid, MgCl, puhvrit, deioniseeritud vett ja mineraalõli. Seejärel asetatakse torud tsüklerisse ja amplifikatsioon viiakse läbi automaatrežiimis vastavalt etteantud programmile, mis vastab patogeeni tüübile. Tulemused registreeritakse sagedamini elektroforeesiga 1-2% agaroosgeelis etiidiumbromiidi juuresolekul, mis ühineb DNA fragmentidega ja tuvastatakse helendavate ribadena, kui geeli kiiritatakse transilluminaatoril UV-kiirtega. Kõik PCR protseduurid võtavad aega 1-2 tööpäeva.

PCR spetsiifilisuse ja tundlikkuse suurendamiseks erinevaid valikuid: pesastatud PCR; PCR "kuumkäivitusega", kasutades parafiinikihti või polümeraasi aktiivsete saitide blokeerimist monoklonaalsete antikehadega. Lisaks toodavad mõned ettevõtted DNA amplifitseerimiseks lüofiliseeritud komplekte, mis kiirendavad PCR protsessi ja vähendavad valepositiivsete tulemuste tõenäosust.

Praegu rakendatakse uus tehnoloogia PCR-PCR reaalajas (Real-Time PCR). Selle põhiomaduseks on polümeraasi ahelreaktsiooni produktide akumuleerumise jälgimine ja kvantitatiivne analüüs ning saadud tulemuste automaatne registreerimine ja tõlgendamine. See meetod ei nõua elektroforeesi etappi, mis vähendab PCR-i laboratoorseid nõudeid. Reaalajas PCR kasutab DNA tuvastamiseks amplifikatsiooni ajal fluorestseeruvalt märgistatud oligonukleotiidsonde. Reaalajas PCR võimaldab proovi täielikku analüüsi 20–60 minuti jooksul ja teoreetiliselt võimaldab tuvastada proovis isegi üksiku DNA või RNA molekuli.

Tootetuvastussüsteem reaalajas polümeraasi ahelreaktsioonis (monitoring PCR) võimaldab jälgida amplifitseeritud DNA kogunemist tsükli kaupa. Süsteem sisaldab oligonukleotiidsondi, mis on võimeline kinnituma (hübridiseeruma) sihtmärk-DNA sisemise segmendi külge. 5' otsas märgistatakse sond fluorestseeruva reportervärviga ja 3' otsas blokeerijaga (kustutusvärv). Kui PCR-produkt akumuleerub, hübridiseerub sond sellega, kuid reporteri ja blokeerija vahelise läheduse tõttu ei teki mingit sära. Järjestuse kopeerimise tulemusena jõuab polümeraas sondi 5' otsa. Polümeraasi 5'-3'-eksonukleaasi aktiivsus eraldab fluorestseeruva märgise sondi 3'-otsast, vabastades seeläbi fluorestseeruva reporteri ühendusest signaali blokeerijaga, mis viib fluorestsentsi suurenemiseni. Fluorestsentsi tase on seega võrdeline konkreetse reaktsioonisaaduse kogusega. On oluline, et PCR tulemused registreeritaks fluorestsentsi olemasoluga suletud katsutites ja seega lahendatakse selle meetodi üks peamisi probleeme - amplikonide saastumise probleem.

PCR eelised: kiire analüüs; kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus; uuritava materjali minimaalne kogus; rakendamise lihtsus ja täieliku automatiseerimise võimalus.

Kuna PCR võib olla sama tundlik kui matriitsi DNA ühe koopia tuvastamine, on valepositiivsete tulemuste oht suur. Seetõttu peab geneetilise diagnostika labor PCR seadistamisel pidevalt järgima paigutuse ja töörežiimi erinõudeid.

PCR on viroloogilises diagnostikas üks täiendavaid meetodeid. See reaktsioon on diagnoosimisel väga oluline viirusnakkused kui viiruse antigeene või viirusspetsiifilisi antikehi ei ole võimalik tuvastada ja kui viiruse nukleiinhappe olemasolu võib olla ainus nakkuse tõend, eriti latentsete ja segainfektsioonide korral.

Kui leiate vea, tõstke esile mõni tekstiosa ja klõpsake Ctrl+Enter.