पोलीमर्स श्रृंखला अभिक्रिया(पीसीआर)- आणविक जीव विज्ञान की प्रायोगिक विधि, जो सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों द्वारा प्रेरित न्यूक्लिक एसिड का एक विशिष्ट प्रवर्धन है कृत्रिम परिवेशीय।

पीसीआर विधि विकसित करने का विचार अमेरिकी शोधकर्ता कैरी मुलिस का है, जिन्होंने 1983 में एक ऐसी विधि बनाई, जिससे डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम का उपयोग करके चक्रीय दोहरीकरण के दौरान डीएनए को बढ़ाना संभव हो गया। कृत्रिम शर्तें. इस विचार के प्रकाशित होने के कुछ वर्षों बाद 1993 में के. मुलिस को इसके लिए नोबेल पुरस्कार मिला।

प्रत्येक लूप के बाद विधि का उपयोग करने की शुरुआत में गर्म करना ठंडा करनाप्रतिक्रिया मिश्रण में डीएनए पोलीमरेज़ को जोड़ा जाना था, क्योंकि यह उच्च तापमान पर जल्दी से निष्क्रिय हो गया था। प्रक्रिया बहुत अक्षम थी, जिसमें बहुत समय और एंजाइम की आवश्यकता होती थी। 1986 में, थर्मोफिलिक बैक्टीरिया से डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके इसे काफी संशोधित किया गया था। ये एंजाइम कई प्रतिक्रिया चक्रों का सामना करने में सक्षम हैं, जो आपको पीसीआर को स्वचालित करने की अनुमति देता है। सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ में से एक को बैक्टीरिया से अलग किया गया है। थर्मस जलीयऔर नाम दिया तक-डीएनए पोलीमरेज़।

विधि का सार।यह विधि एंजाइम टाक-डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके एक निश्चित डीएनए क्षेत्र की कई चयनात्मक नकल पर आधारित है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन से लंबाई में कई हज़ार बेस पेयर तक के एम्पलीफ़िकेशन प्राप्त करना संभव हो जाता है। पीसीआर उत्पाद की लंबाई को 20-40 हजार आधार जोड़े तक बढ़ाने के लिए, विभिन्न पोलीमरेज़ के मिश्रण का उपयोग किया जाता है, लेकिन यह अभी भी एक यूकेरियोटिक कोशिका के क्रोमोसोमल डीएनए की लंबाई से बहुत कम है।

प्रतिक्रिया एक प्रोग्राम करने योग्य थर्मोस्टेट (एम्पलीफायर) में की जाती है - एक उपकरण जो काफी तेजी से प्रदर्शन कर सकता है

टेस्ट ट्यूबों को ठंडा और गर्म करना (आमतौर पर कम से कम 0.1 डिग्री सेल्सियस की सटीकता के साथ)। एम्पलीफायर आपको "हॉट स्टार्ट" और बाद के स्टोरेज की संभावना वाले जटिल प्रोग्राम सेट करने की अनुमति देते हैं। रीयल-टाइम पीसीआर के लिए, फ्लोरोसेंट डिटेक्टर से लैस उपकरणों का उत्पादन किया जाता है। उपकरण स्वचालित ढक्कन और माइक्रोप्लेट डिब्बे के साथ भी उपलब्ध हैं, जिससे उन्हें स्वचालित सिस्टम में एकीकृत किया जा सकता है।

आमतौर पर, पीसीआर के दौरान, 20-45 चक्र किए जाते हैं, जिनमें से प्रत्येक में तीन चरण होते हैं: विकृतीकरण, प्राइमर एनीलिंग, बढ़ाव (चित्र। 6.1 और 6.2)। अंजीर पर। 6.1 पीसीआर चक्र के दौरान टेस्ट ट्यूब में तापमान परिवर्तन की गतिशीलता को दर्शाता है।

चावल। 6.1।पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के एक चक्र के दौरान टेस्ट ट्यूब में तापमान में बदलाव का ग्राफ

डीएनए टेम्पलेट विकृतीकरणप्रतिक्रिया मिश्रण को 5-90 एस के लिए 94-96 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके किया जाता है ताकि डीएनए श्रृंखला फैल जाए। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पहले चक्र से पहले, प्रारंभिक मैट्रिक्स को पूरी तरह से विकृत करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण को 2-5 मिनट के लिए पहले से गरम किया जाता है, जिससे गैर-विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादों की मात्रा को कम करना संभव हो जाता है।

चावल। 6.2।पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के पहले चक्र की योजना

प्राइमर एनीलिंग चरण।तापमान में धीरे-धीरे कमी के साथ, प्राइमर पूरक रूप से टेम्पलेट से जुड़ते हैं। एनीलिंग तापमान प्राइमरों की संरचना पर निर्भर करता है और आमतौर पर परिकलित पिघलने के तापमान से 4-5 डिग्री सेल्सियस कम होता है। चरण की अवधि 5-60 एस है।

अगले चरण के दौरान- बढ़ाव- मातृ मैट्रिक्स पर डीएनए के बेटी स्ट्रैंड का संश्लेषण होता है। बढ़ाव तापमान पोलीमरेज़ पर निर्भर करता है। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले टाक और पीएफयू डीएनए पोलीमरेज़ 72 डिग्री सेल्सियस पर सबसे अधिक सक्रिय होते हैं। बढ़ाव का समय, मुख्य रूप से पीसीआर उत्पाद की लंबाई पर निर्भर करता है, आमतौर पर प्रति 1000 आधार जोड़े में 1 मिनट होता है।

संतुष्ट

जो लोग नई नैदानिक ​​विधियों में रुचि रखते हैं उन्हें पता लगाना चाहिए कि पीसीआर पद्धति क्या है। क्षेत्र में आधुनिक तकनीकी क्षमताएं प्रयोगशाला अनुसंधानकई बीमारियों का पता लगाने का अवसर प्रदान करें शुरुआती अवस्था. पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) को वर्तमान में सबसे सटीक और नई विधि माना जाता है।

पीसीआर विश्लेषण

पीसीआर विश्लेषण - यह क्या है? यह विधि आणविक जीव विज्ञान के सिद्धांतों का उपयोग करती है। सामग्री का अध्ययन करने के लिए, विशेष एंजाइमों का उपयोग किया जाता है जो बार-बार और जल्दी से डीएनए, रोगजनकों के आरएनए टुकड़े की नकल करते हैं। मौजूद अलग - अलग प्रकारअध्ययन की जा रही सामग्री (रक्त, मूत्र, मल, आदि) के आधार पर पीसीआर विश्लेषण। प्रसंस्करण के बाद, प्रयोगशाला कर्मचारी डेटाबेस के साथ परिणाम की तुलना करते हैं, एकाग्रता, रोगज़नक़ के प्रकार की पहचान करते हैं।

पीसीआर विश्लेषण को एक विशेष एम्पलीफायर (डिवाइस) में रखा जाता है जो बायोमटेरियल के साथ टेस्ट ट्यूब को गर्म और ठंडा करता है। खंड प्रतिकृति के लिए तापमान परिवर्तन की आवश्यकता होती है। परिणाम की सटीकता तापमान शासन की सटीकता पर निर्भर करेगी। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विधि पहचानने में मदद करती है:

• संक्रामक मोनोन्यूक्लियोसिस;
• साइटोमेगालोवायरस संक्रमण;
• वायरल हेपेटाइटिस जी, सी, बी, ए;
• यौन संचारित संक्रमण / रोग (एसटीआई / एसटीडी): गार्डनरेलोसिस, ट्राइकोमोनिएसिस, यूरियाप्लास्मोसिस;
• हर्पेटिक संक्रमण;
• ऑन्कोजेनिक वायरस;
• लिस्टेरियोसिस;
• हेलिकोबैक्टर संक्रमण;
• टिक - जनित इन्सेफेलाइटिस, बोरेलिओसिस;
• तपेदिक;
• कैंडिडिआसिस।

खून

फिलहाल, प्रौद्योगिकी की नवीनता के कारण, पीसीआर रक्त परीक्षण की अभी भी उच्च कीमत है। बायोमटेरियल की तैयारी के लिए कुछ आवश्यकताओं का पालन करना जरूरी नहीं है। कारण भी बना शारीरिक गतिविधि, तनाव, आहार में परिवर्तन, रचना में परिवर्तन अध्ययन के परिणाम को प्रभावित नहीं करते हैं। एक पीसीआर रक्त परीक्षण केवल जीवाणुरोधी एजेंटों के सेवन को खराब कर सकता है, इसलिए इसे लेने से पहले, उपचार और परीक्षण के बीच रुकना आवश्यक है।

वायरल या एटिपिकल अभिव्यक्ति के साथ पुरानी, ​​​​तीव्र संक्रामक विकृतियों के निदान के लिए पीसीआर रक्त परीक्षण सबसे आम विकल्प है। सीरोलॉजिकल रिसर्च के तरीकों को पूरा करने में एक निश्चित कठिनाई होती है - एक रोगज़नक़ की उपस्थिति मानव शरीर में एंटीबॉडी की उपस्थिति से निर्धारित होती है। यदि रोगी की स्थिति ने उनके विकास के लिए समय नहीं दिया तो परिणाम गलत नकारात्मक हो सकता है।

धब्बा

स्त्री रोग के क्षेत्र में, संक्रामक सूक्ष्मजीवों की उपस्थिति का अध्ययन करने के लिए पीसीआर स्मीयर विश्लेषण का उपयोग किया जाता है। सामग्री के साथ काम करना रक्त के समान सिद्धांत के अनुसार किया जाता है: आसानी से पहचानने के लिए रोगज़नक़ के डीएनए के टुकड़ों में एक से अधिक वृद्धि। पता लगाने में भी मदद करता है छिपे हुए संक्रमणएक महिला पर। विश्लेषण के लिए विभिन्न जैविक तरल पदार्थ लिए जा सकते हैं: लार, थूक, मूत्र, रक्त। स्त्री रोग में, निर्धारण की सटीकता के लिए, ग्रीवा नहर से योनि के श्लेष्म से एक धब्बा अधिक बार उपयोग किया जाता है।

पीसीआर के लिए कुछ संकेत हैं। एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी प्रकार के रोगज़नक़ की पहचान करने के लिए अक्सर इसे करने की आवश्यकता होती है। महिलाओं में, इस विधि द्वारा निदान के लिए मुख्य संकेत हैं:

• एक गर्भावस्था जो कठिन है;
• एसटीआई का तीव्र चरण;
• यदि एसटीआई के हस्तांतरण का संदेह है जीर्ण अवस्था;
• बांझपन के कारणों की खोज।

कैला

संक्रमण का पता लगाने के लिए, डॉक्टर द्वारा फेकल पीसीआर परीक्षण निर्धारित किया जा सकता है। परीक्षण के बाद सबसे विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, बायोमटेरियल लेने से पहले निम्नलिखित नियमों का पालन करना आवश्यक है:

• कुछ दिनों के लिए जुलाब लेना बंद करें: तेल, सपोसिटरी;
• उन दवाओं को बाहर करें जो मल को एक विशिष्ट रंग देती हैं, उदाहरण के लिए, लौह सामग्री के साथ।

मूत्र

यदि आवश्यक हो, तो डॉक्टर परीक्षण के लिए मूत्र ले सकते हैं। उच्च सटीकता किसी भी जैविक द्रव के साथ काम करने की संभावना को खोलती है जिससे वायरस डीएनए निकालना संभव है। पीसीआर यूरिन टेस्ट पास करने के लिए, आपको सामग्री लेने से पहले निम्नलिखित प्रतिबंधों का पालन करना होगा:

• प्रक्रिया से कम से कम 1 दिन पहले, संभोग बंद करो;
• प्रसव से 3 सप्ताह पहले, कोई भी जीवाणुरोधी उपचार पूरा किया जाना चाहिए, क्योंकि दवाएं तस्वीर को धुंधला कर देंगी;
• आपको खाली पेट परीक्षण करने की आवश्यकता है (तरल भी निषिद्ध है);
• आपको सामग्री का पहला सुबह का हिस्सा लेने की आवश्यकता है।

पीसीआर परीक्षण के परिणाम

ऊपर से, यह स्पष्ट है कि पीसीआर विश्लेषण क्या है और इस शोध पद्धति के स्पष्ट लाभ दिखाई दे रहे हैं। इस निदान प्रक्रिया का एक और प्लस परिणामों को समझने में आसानी है। यह देखते हुए कि कितना पीसीआर विश्लेषण किया जाता है (प्रक्रिया में लगभग 5 घंटे लगते हैं, लेकिन प्रयोगशाला 1-2 दिनों में डेटा जारी करती है), यह निदान पद्धति कई संक्रमणों का निर्धारण करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प बन जाती है। परिणामों के आधार पर, आपका डॉक्टर आपको बता सकता है कि परीक्षण:

1. नकारात्मक - अध्ययन की गई सामग्री में वांछित रोगज़नक़ नहीं था।
2. पॉजिटिव- पैथोजेन के आरएनए, डीएनए मिले।

कभी-कभी सूक्ष्मजीवों का मात्रात्मक निर्धारण किया जाता है। अवसरवादी रोगजनकों का कारण बनने वाली बीमारियों के लिए यह आवश्यक है। इन विषाणुओं की ख़ासियत यह है कि वे केवल अधिक मात्रा में दिखाई देते हैं और पारंपरिक अध्ययनों से उनका पता लगाना बेहद मुश्किल है। यह कारक चुनने के लिए महत्वपूर्ण है चिकित्सीय रणनीतिहेपेटाइटिस, एचआईवी जैसे वायरल संक्रमणों का प्रभावी ढंग से इलाज करने के लिए।

12 संक्रमणों के लिए

पूरी तरह से समझने के लिए कि पीसीआर संक्रमणों के निदान के लिए क्या है और यह कितना प्रभावी है, आपको यह जानना होगा कि यह 12 रोगजनकों को अलग करने में सक्षम है। पाठ केवल प्रयोगशाला स्थितियों में किया जाता है। अनुसंधान के लिए विशेष एंजाइमों का उपयोग किया जाता है, जो वायरस के आरएनए, डीएनए अंशों की मात्रा को कई गुना बढ़ा देते हैं। 12 संक्रमणों के लिए पीसीआर विश्लेषण से पता चल सकता है:

• माइकोबैक्टेरियम ट्यूबरक्यूलोसिस;
• साइटोमेगालो वायरस;
• हेपेटाइटिस सी, जी, बी, ए;
• दाद 1, 2 प्रकार;
• एपस्टीन-बार वायरस (संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस);
• संक्रमण जो यौन संचारित होते हैं, उदाहरण के लिए, क्लैमाइडिया;
• लिस्टेरियोसिस;
• कैंडिडा संक्रमण;
• हैलीकॉप्टर पायलॉरी;
• बोरेलिओसिस, टिक-जनित एन्सेफलाइटिस।

हेपेटाइटिस सी के लिए

यह निदान पद्धति रक्त में वायरस की उपस्थिति को निर्धारित करने में मदद करती है। इससे डॉक्टरों को अपनी उपस्थिति या अनुपस्थिति के बारे में बात करने का मौका मिलता है। हेपेटाइटिस सी के लिए पीसीआर विश्लेषण दो प्रकार के होते हैं: गुणात्मक और मात्रात्मक। पहला विकल्प केवल इसकी उपस्थिति को इंगित करता है और इसे "पता लगाया गया" / "पता नहीं लगाया गया" कहा जा सकता है। इस प्रकार के परीक्षण में 10-500 IU/ml की संवेदनशीलता होती है। इससे पता चलता है कि शरीर में रोगज़नक़ की कम सामग्री के साथ, विश्लेषण "पता नहीं" होगा।

मात्रात्मक विश्लेषण अधिक सटीक है और रक्त में संक्रमण की एकाग्रता दिखाएगा। इस सूचक को "वायरल लोड" के रूप में नामित किया गया है, जिसे प्रति विशिष्ट रक्त मात्रा में वायरल आरएनए की मात्रा में मापा जाता है। विभिन्न प्रयोगशालाओं में डिक्रिप्शन भिन्न हो सकता है। IU / ml में मापने के अलावा, "कॉपी" इकाइयों का उपयोग किया जाता है। आप सूत्र का उपयोग करके प्रति IU प्रतियों की पुनर्गणना कर सकते हैं: 1 IU = 4 प्रतियां। यदि प्रतिलेख में वायरस की उपस्थिति का मान 800,000 IU / ml (या 800 * 103) से अधिक है, तो यह रोगज़नक़ की उच्च सामग्री को इंगित करता है।

तपेदिक के लिए

परीक्षण सुबह में किया जाना चाहिए। रात के दौरान बनने वाली सभी थूक को पेट से बाहर निकलने से रोकने के लिए यह महत्वपूर्ण है। तपेदिक के लिए पीसीआर विश्लेषण एलिसा, मंटौक्स, टोमोग्राफी जितना ही महत्वपूर्ण है। परीक्षण माइकोबैक्टीरिया, मूत्र की स्थिति की उपस्थिति को उजागर करने में मदद करता है, कुल इम्युनोग्लोबुलिन, ईएसआर, इस समय फेफड़ों की स्थिति निर्धारित करें। पीसीआर के विश्लेषण में परिणाम प्राप्त करने की सटीकता के लिए, इसे निम्नलिखित नियमों के अनुपालन में करना आवश्यक है:

1. बुवाई 3 बार की जाती है, लेकिन पेट की सामग्री की पूरी आकांक्षा केवल एक अस्पताल में ही की जानी चाहिए।
2. निदान के 50% से कम में पेट में मौजूदा द्रव्यमान की संस्कृति द्वारा माइकोबैक्टीरिया का पता लगाता है। इष्टतम स्थितियां प्राप्त होने पर भी, इसके बजाय अल्ट्रासाउंड की सिफारिश की जाती है।
3. यहां तक ​​कि एक नकारात्मक परिणाम के साथ, ईएसआर, इम्युनोग्लोबुलिन या अन्य संकेतकों में बदलाव के साथ तपेदिक के विकास की संभावना को पूरी तरह से बाहर नहीं किया जा सकता है।
4. पीसीआर कल्चर पैथोलॉजिकल स्थितियों के प्रति कम संवेदनशील होता है यदि इसे ब्रोंकोस्कोपिक परीक्षा के भाग के रूप में प्राप्त किया जाता है, जिसमें एक बच्चे में टीबी का संदेह शामिल नहीं होता है।

एचआईवी के लिए

कई लोगों के लिए, इस निदान को मौत की सजा माना जाता है। इस कारण से, लगातार संभोग के बाद, एक व्यक्ति उन संकेतों के प्रति अधिक चौकस हो जाता है जो उसका शरीर देता है (और कभी-कभी उनके साथ आता है)। इस बीमारी की पुष्टि या खंडन प्राप्त करने का सबसे विश्वसनीय विकल्प एचआईवी के लिए पीसीआर परीक्षण है। निम्नलिखित को निर्धारित करने के लिए परीक्षण का उपयोग किया जा सकता है संभावित समस्याएंस्वास्थ्य के साथ:

1. सेरोनिगेटिव घोड़े की अवधि के दौरान एचआईवी की उपस्थिति से इनकार/पुष्टि।
2. एचआईवी -1, एचआईवी -2 के जीनोटाइप का निर्धारण।
3. इम्युनोब्लॉट के संदिग्ध परिणाम के साथ रोग प्रक्रिया के विवरण का स्पष्टीकरण।
4. रक्त आधान के बाद संक्रमण।
5. वाहक माताओं से पैदा हुए बच्चों में एचआईवी स्थिति का निर्धारण।
6. शरीर के वायरल लोड की निगरानी स्थापित करने में मदद करता है।

एचपीवी के लिए

पैपिलोमा वायरस किसी भी व्यक्ति में पाया जा सकता है, यह लंबे समय तक अव्यक्त अवस्था में हो सकता है। विकास प्रतिरक्षा प्रणाली, तनाव या भावनात्मक प्रकोप के कमजोर होने को भड़काता है। एचपीवी के लिए पीसीआर विश्लेषण रक्त में वायरस की एकाग्रता को निर्धारित करने में मदद करता है। इस कारण से, गुणात्मक के बजाय मात्रात्मक निर्धारण करने की अनुशंसा की जाती है। ये डेटा संक्रमण की घातक प्रकृति के विकास की संभावना का अनुमान लगाने में मदद करेंगे।

एचपीवी की उपस्थिति का निदान करने की तकनीक सामग्री से वायरस डीएनए को अलग करने के लिए पीसीआर की मुख्य संपत्ति पर आधारित है। परीक्षण की उच्च संवेदनशीलता के कारण, बैक्टीरिया की थोड़ी मात्रा का भी पता चल जाएगा। मात्रात्मक अनुसंधान डॉक्टरों को भविष्य के लिए रोग का निदान करने के लिए रोग के खतरे की डिग्री निर्धारित करने का अवसर देता है। यह निदान उन सभी पुरुषों और महिलाओं के लिए अनिवार्य है, जिन्होंने खुद को मौसा के साथ पाया है। मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण यह निर्धारित करने में मदद करेगा कि एचपीवी के विकास का कारण क्या है: प्रतिरक्षा या पुरानी बीमारी में अस्थायी कमी।

दाद के लिए

सूक्ष्म जीव विज्ञान में इस प्रकार के निदान उच्च सटीकता के साथ दाद के लिए पीसीआर विश्लेषण करने में मदद करते हैं। सामग्री में वांछित जीन मौजूद होने पर ही वायरस के डीएनए अंशों की प्रतिलिपि बनाई जाएगी। इस मामले में, आचरण के परिणामों के आधार पर परीक्षण रोगज़नक़ की उपस्थिति या अनुपस्थिति का संकेत दे सकता है। रक्त में कम सांद्रता पर भी इसका पता लगाना संभव होगा।

पीसीआर विश्लेषण का एक और प्लस यह है कि यह नैदानिक ​​​​लक्षणों की शुरुआत से पहले, संक्रमण के तुरंत बाद दाद वायरस के संक्रमण का पता लगा सकता है। दाद के प्रकार (1 या 2) को निर्धारित करना संभव है, विश्लेषण पास करने के लिए किसी विशेष तैयारी की आवश्यकता नहीं है, लेकिन डॉक्टर सलाह देते हैं कि आप रक्त लेने से पहले मना कर दें:

• तला हुआ;
• तीव्र;
• अल्कोहल;
• मोटे।

गर्भावस्था के दौरान

बच्चे को ले जाते समय, यह बहुत महत्वपूर्ण है ये अध्ययनमहिला की स्थिति का पता लगाने के लिए। गर्भावस्था के दौरान पीसीआर विश्लेषण सबसे अधिक में से एक है प्रभावी तरीकेविभिन्न रोगों की उपस्थिति का निर्धारण। न केवल पैथोलॉजी की पहचान करने के लिए, बल्कि गर्भाशय में बच्चे के संक्रमण की संभावना निर्धारित करने के लिए भी एक परीक्षण करना आवश्यक है। केवल पीसीआर डायग्नोस्टिक्स के लिए धन्यवाद, प्रगति की डिग्री की पहचान करना संभव हो गया, मां के गर्भ के अंदर कई संक्रमणों का विकास।

पीसीआर विश्लेषण का वितरण

यदि आप सोच रहे हैं कि पीसीआर विश्लेषण कैसे लिया जाता है, तो बायोमटेरियल के प्रकार को ध्यान में रखते हुए प्रत्येक व्यक्तिगत मामले पर विचार किया जाना चाहिए। स्क्रैपिंग, स्मीयर या ब्लड सैंपलिंग की अपनी विशेषताएं हैं, उदाहरण के लिए:

• प्लाज्मा सुबह दान किया जाता है;
• एक बाँझ कंटेनर में प्रयोगशाला स्थितियों के तहत मूत्र केवल सुबह में पहली बार लिया जाता है;
• कम से कम 3 दिनों तक संभोग से दूर रहने के बाद ही एक धब्बा या खुरचनी सांकेतिक होगी;
• आप मासिक धर्म के दौरान और उसके 2 दिन बाद स्मीयर नहीं ले सकती हैं।

पीसीआर की जांच कहां कराएं

इस प्रकार का शोध आधुनिक और उच्च तकनीकी निदान विधियों को संदर्भित करता है। पीसीआर परीक्षण उन प्रयोगशालाओं में किए जाने चाहिए जिनमें पूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए सभी आवश्यक कॉम्प्लेक्स हों। योग्य और प्रशिक्षित कर्मी समान रूप से महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। बड़ी, गंभीर, प्रसिद्ध प्रयोगशालाओं को वरीयता दें। यह न केवल परिणाम जल्दी प्राप्त करने में मदद करेगा, बल्कि उनकी विश्वसनीयता भी सुनिश्चित करेगा।

कीमत

एक और सवाल जो रोगियों के लिए अक्सर दिलचस्प होता है: पीसीआर परीक्षण की लागत कितनी है? विधि की नवीनता के कारण, महंगे उपकरण खरीदने की आवश्यकता, परीक्षण की कीमत अपेक्षाकृत अधिक है। पीसीआर की लागत संक्रमण के प्रकार से प्रभावित होती है जिसके लिए एक व्यक्ति का परीक्षण किया जाएगा। अनुमानित मूल्य और परीक्षणों की शर्तें इस प्रकार हैं:

1. एसटीआई की जाँच 1 दिन में की जाएगी, कीमत 400-500 रूबल है।
2. हरपीज, एचपीवी, एपस्टीन-बार वायरस, साइटोमेग्लोवायरस प्रति दिन पाए जाते हैं, कीमत 300-500 रूबल है।
3. हेपेटाइटिस के लिए एक विश्लेषण 5 दिनों में किया जाता है, गुणात्मक विकल्प के लिए कीमत 500 रूबल है, मात्रात्मक एक - 2000 रूबल के लिए।
4. हेलिकोबैक्टर पाइलोरी प्रति दिन पाया जाता है, कीमत 400 रूबल है।
5. एंटीजन, एचआईवी एंटीबॉडी, मूल्य - 380 रूबल से।
6. गुणात्मक विश्लेषणएचआईवी आरएनए, मूल्य - 3,500 रूबल से।
7. एचआईवी आरएनए का मात्रात्मक विश्लेषण, मूल्य - 11,000 रूबल से।

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ध्यान!लेख में दी गई जानकारी केवल सूचनात्मक उद्देश्यों के लिए है। लेख की सामग्री की मांग नहीं है आत्म उपचार. केवल एक योग्य चिकित्सक ही निदान कर सकता है और किसी विशेष रोगी की व्यक्तिगत विशेषताओं के आधार पर उपचार के लिए सिफारिशें दे सकता है।

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पर्याप्त और के लिए प्रभावी उपचारअनेक संक्रामक रोगएक सटीक निदान की समय पर स्थापना आवश्यक है। आज इस समस्या को हल करने में आणविक जीव विज्ञान के तरीकों पर आधारित उच्च तकनीक निदान पद्धति शामिल है। फिलहाल, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) पहले से ही व्यापक रूप से व्यावहारिक चिकित्सा में सबसे विश्वसनीय प्रयोगशाला निदान उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता है।

वर्तमान समय में पीसीआर की लोकप्रियता क्या बताती है?

सबसे पहले, इस पद्धति का उपयोग विभिन्न संक्रामक रोगों के रोगजनकों की उच्च सटीकता के साथ पहचान करने के लिए किया जाता है।

दूसरे, उपचार की प्रभावशीलता की निगरानी करने के लिए।

विभिन्न मैनुअल, प्रॉस्पेक्टस, लेख, साथ ही चिकित्सा विशेषज्ञों के स्पष्टीकरण में, हम अक्सर समझ से बाहर के शब्दों और शब्दों के उपयोग का सामना करते हैं। विज्ञान के उच्च तकनीकी उत्पादों के बारे में सामान्य शब्दों में बात करना वास्तव में कठिन है।

पीसीआर डायग्नोस्टिक्स का सार और यांत्रिकी क्या है?

प्रत्येक जीवित जीव का अपना अनूठा जीन होता है। जीन डीएनए अणु में स्थित होते हैं, जो वास्तव में प्रत्येक विशिष्ट जीव का "कॉलिंग कार्ड" होता है। डीएनए (आनुवांशिक सामग्री) एक बहुत लंबा अणु है जो न्यूक्लियोटाइड नामक बिल्डिंग ब्लॉक्स से बना होता है। संक्रामक रोगों के प्रत्येक रोगज़नक़ के लिए, वे कड़ाई से विशिष्ट हैं, अर्थात् एक निश्चित क्रम और संयोजन में। जब यह समझना आवश्यक हो जाता है कि क्या किसी व्यक्ति के पास एक विशेष रोगज़नक़ है, तो जैविक सामग्री (रक्त, मूत्र, लार, स्मीयर) ली जाती है, जिसमें माइक्रोब के डीएनए या डीएनए टुकड़े होते हैं। लेकिन रोगज़नक़ की आनुवंशिक सामग्री की मात्रा बहुत कम है, और यह कहना असंभव है कि यह किस सूक्ष्मजीव का है। इस समस्या को हल करने के लिए पीसीआर काम करता है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन का सार यह है कि डीएनए युक्त अनुसंधान के लिए थोड़ी मात्रा में सामग्री ली जाती है, और पीसीआर प्रक्रिया के दौरान, एक विशेष रोगज़नक़ से संबंधित आनुवंशिक सामग्री की मात्रा बढ़ जाती है और इस प्रकार, इसकी पहचान की जा सकती है।

पीसीआर डायग्नोस्टिक्स बायोमटेरियल का अनुवांशिक अध्ययन है।

पीसीआर पद्धति का विचार अमेरिकी वैज्ञानिक के मुलिन्स का है, जिसे उन्होंने 1983 में प्रस्तावित किया था। हालाँकि, विस्तृत नैदानिक ​​आवेदन XX सदी के 90 के दशक के मध्य में ही प्राप्त हुआ।

आइए शब्दावली से निपटें, यह क्या है - डीएनए, आदि। किसी भी जीवित प्राणी (जानवर, पौधे, मानव, बैक्टीरिया, वायरस) की प्रत्येक कोशिका में गुणसूत्र होते हैं। गुणसूत्र आनुवंशिक जानकारी के संरक्षक होते हैं जिनमें प्रत्येक विशेष जीवित प्राणी के जीनों का संपूर्ण अनुक्रम होता है।

प्रत्येक गुणसूत्र डीएनए के दो तंतुओं से बना होता है जो एक दूसरे के सापेक्ष एक हेलिक्स में मुड़ जाते हैं। डीएनए रासायनिक रूप से डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड होता है, जिसमें संरचनात्मक घटक होते हैं - न्यूक्लियोटाइड्स। 5 प्रकार के न्यूक्लियोटाइड होते हैं - थाइमिन (टी), एडेनोसिन (ए), गुआनिन (जी), साइटोसिन (सी) और यूरैसिल (यू)। न्यूक्लियोटाइड एक के बाद एक सख्त व्यक्तिगत अनुक्रम में व्यवस्थित होते हैं, जिससे जीन बनते हैं। एक जीन में 20-200 ऐसे न्यूक्लियोटाइड हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, जीन एन्कोडिंग इंसुलिन उत्पादन 60 आधार जोड़े लंबा है।

न्यूक्लियोटाइड्स में संपूरकता का गुण होता है। इसका मतलब यह है कि डीएनए के एक स्ट्रैंड में विपरीत एडेनिन (ए) हमेशा दूसरे स्ट्रैंड में थाइमिन (टी) होता है, और गुआनिन (जी) के विपरीत - साइटोसिन (सी)। योजनाबद्ध रूप से ऐसा दिखता है:
जी - सी
टी - ए
पर
संपूरकता का यह गुण पीसीआर के लिए महत्वपूर्ण है।

डीएनए के अलावा, आरएनए में एक ही संरचना होती है - राइबोन्यूक्लिक एसिड, जो डीएनए से भिन्न होता है जिसमें यह थाइमिन के बजाय यूरैसिल का उपयोग करता है। आरएनए - कुछ वायरस में अनुवांशिक जानकारी का रखरखाव है, जिसे रेट्रोवायरस कहा जाता है (उदाहरण के लिए, एचआईवी)।

डीएनए और आरएनए अणु "गुणा" कर सकते हैं (यह संपत्ति पीसीआर के लिए उपयोग की जाती है)। यह निम्नानुसार होता है: डीएनए या आरएनए के दो स्ट्रैंड एक दूसरे से दूर की ओर जाते हैं, प्रत्येक धागे पर एक विशेष एंजाइम बैठता है, जो एक नई श्रृंखला को संश्लेषित करता है। संश्लेषण पूरकता के सिद्धांत के अनुसार आगे बढ़ता है, अर्थात, यदि न्यूक्लियोटाइड ए मूल डीएनए श्रृंखला में है, तो टी नए संश्लेषित एक में होगा, यदि जी - तो सी, आदि। संश्लेषण शुरू करने के लिए इस विशेष "बिल्डर" एंजाइम को "बीज" - 5-15 न्यूक्लियोटाइड का अनुक्रम चाहिए। यह "बीज" प्रत्येक जीन के लिए परिभाषित किया गया है (क्लैमाइडिया जीन, माइकोप्लाज़्मा, वायरस) प्रयोगात्मक रूप से।

इसलिए, प्रत्येक पीसीआर चक्र में तीन चरण होते हैं। पहले चरण में, डीएनए की तथाकथित अनइंडिंग होती है - यानी, एक दूसरे से जुड़े डीएनए की दो किस्में अलग हो जाती हैं। दूसरे में, "बीज" डीएनए स्ट्रैंड के एक हिस्से से जुड़ा होता है। और, अंत में, इन डीएनए स्ट्रैंड्स का बढ़ाव, जो "बिल्डर" एंजाइम द्वारा निर्मित होता है। वर्तमान में, यह पूरी जटिल प्रक्रिया एक टेस्ट ट्यूब में होती है और इसमें प्राप्त करने के लिए डीएनए के पुनरुत्पादन के चक्रों को निर्धारित किया जाता है। एक लंबी संख्याप्रतियां जिन्हें तब पारंपरिक तरीकों से पहचाना जा सकता है। यानी डीएनए के एक स्ट्रैंड से हमें सैकड़ों या हजारों मिलते हैं।

एक पीसीआर अध्ययन के चरण

अनुसंधान के लिए जैविक सामग्री का संग्रह

विभिन्न जैविक सामग्री एक नमूने के रूप में कार्य करती हैं: रक्त और उसके घटक, मूत्र, लार, श्लेष्म झिल्ली के स्राव, मस्तिष्कमेरु द्रव, घाव की सतहों से निर्वहन, शरीर के गुहाओं की सामग्री। सभी जैव नमूने डिस्पोजेबल उपकरणों के साथ एकत्र किए जाते हैं, और एकत्रित सामग्री को बाँझ प्लास्टिक ट्यूबों में रखा जाता है या संस्कृति मीडिया पर रखा जाता है, जिसके बाद प्रयोगशाला में परिवहन किया जाता है।

आवश्यक अभिकर्मकों को लिए गए नमूनों में जोड़ा जाता है और एक प्रोग्राम करने योग्य थर्मोस्टैट - एक थर्मल साइक्लर (एम्पलीफायर) में रखा जाता है। साइकिलर में, पीसीआर चक्र को 30-50 बार दोहराया जाता है, जिसमें तीन चरण होते हैं (विकृतीकरण, एनीलिंग और बढ़ाव)। इसका अर्थ क्या है? आइए अधिक विस्तार से विचार करें।

तत्काल पीसीआर प्रतिक्रिया के चरण, अनुवांशिक सामग्री की प्रतिलिपि बनाना

मैंपीसीआर चरण - नकल के लिए अनुवांशिक सामग्री की तैयारी।
95 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर होता है, जबकि डीएनए किस्में काट दी जाती हैं, और "बीज" उन पर बैठ सकते हैं।

"बीज" विभिन्न अनुसंधान और उत्पादन संघों द्वारा औद्योगिक रूप से निर्मित होते हैं, और प्रयोगशालाएँ तैयार-निर्मित खरीदती हैं। उसी समय, "बीज" का पता लगाने के लिए, उदाहरण के लिए, क्लैमाइडिया, केवल क्लैमाइडिया आदि के लिए काम करता है। इस प्रकार, यदि क्लैमाइडियल संक्रमण की उपस्थिति के लिए बायोमटेरियल का परीक्षण किया जाता है, तो प्रतिक्रिया मिश्रण में क्लैमिडिया के लिए "बीज" रखा जाता है; यदि एपस्टीन-बार वायरस के लिए बायोमटेरियल का परीक्षण किया जाता है, तो एपस्टीन-बार वायरस के लिए "बीज"।

द्वितीयचरण - संक्रामक एजेंट और "बीज" की अनुवांशिक सामग्री का संयोजन।
यदि वायरस या जीवाणु का डीएनए निर्धारित किया जाना है, तो इस डीएनए पर "बीज" बैठता है। यह प्राइमर जोड़ने की प्रक्रिया पीसीआर का दूसरा चरण है। यह चरण 75 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर होता है।

तृतीयचरण - संक्रामक एजेंट की अनुवांशिक सामग्री की प्रतिलिपि बनाना।
यह आनुवंशिक सामग्री के वास्तविक बढ़ाव या पुनरुत्पादन की प्रक्रिया है, जो 72°C पर होती है। एक एंजाइम-बिल्डर "बीज" तक पहुंचता है और डीएनए के एक नए स्ट्रैंड को संश्लेषित करता है। एक नए डीएनए स्ट्रैंड के संश्लेषण की समाप्ति के साथ, पीसीआर चक्र भी समाप्त हो जाता है। यानी एक पीसीआर चक्र में अनुवांशिक सामग्री की मात्रा दोगुनी हो जाती है। उदाहरण के लिए, प्रारंभिक नमूने में एक वायरस के 100 डीएनए अणु थे, पहले पीसीआर चक्र के बाद नमूने में पहले से ही परीक्षण किए गए वायरस के 200 डीएनए अणु होंगे। एक चक्र 2-3 मिनट तक रहता है।

पहचान के लिए पर्याप्त आनुवंशिक सामग्री उत्पन्न करने के लिए आमतौर पर 30-50 पीसीआर चक्र किए जाते हैं, जिसमें 2-3 घंटे लगते हैं।

प्रचारित आनुवंशिक सामग्री की पहचान का चरण

पीसीआर स्वयं यहीं समाप्त हो जाता है और फिर पहचान का समान रूप से महत्वपूर्ण चरण आता है। पहचान के लिए, वैद्युतकणसंचलन या "बीज" लेबल का उपयोग किया जाता है। वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करते समय, परिणामी डीएनए किस्में आकार से अलग हो जाती हैं, और विभिन्न लंबाई के डीएनए टुकड़ों की उपस्थिति इंगित करती है एक सकारात्मक परिणामविश्लेषण (अर्थात, एक विशेष वायरस, बैक्टीरिया, आदि की उपस्थिति)। लेबल वाले "बीज" का उपयोग करते समय, एक क्रोमोजेन (डाई) को प्रतिक्रिया के अंतिम उत्पाद में जोड़ा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक रंग के गठन के साथ एंजाइमी प्रतिक्रिया होती है। एक रंग का विकास सीधे इंगित करता है कि मूल नमूने में एक वायरस या अन्य पता लगाने योग्य एजेंट मौजूद है।

आज, लेबल किए गए "बीज", साथ ही उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, पीसीआर परिणामों को तुरंत "पढ़ना" संभव है। यह तथाकथित रीयल-टाइम पीसीआर है।

पीसीआर डायग्नोस्टिक्स इतना मूल्यवान क्यों है?

पीसीआर पद्धति के महत्वपूर्ण लाभों में से एक इसकी उच्च संवेदनशीलता है - 95 से 100% तक। हालाँकि, ये लाभ निम्नलिखित शर्तों के अनिवार्य पालन पर आधारित होने चाहिए:

1. सही नमूनाकरण, जैविक सामग्री का परिवहन;
2. बाँझ, डिस्पोजेबल उपकरणों, विशेष प्रयोगशालाओं और प्रशिक्षित कर्मियों की उपलब्धता;
3. विश्लेषण के दौरान कार्यप्रणाली और बाँझपन का सख्त पालन

अलग-अलग रोगाणुओं का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता भिन्न होती है। इसलिए, उदाहरण के लिए, हेपेटाइटिस सी वायरस का पता लगाने के लिए पीसीआर विधि की संवेदनशीलता 97-98% है, यूरियाप्लाज्मा का पता लगाने की संवेदनशीलता 99-100% है।

पीसीआर विश्लेषण में निहित क्षमताएं आपको नायाब विश्लेषणात्मक विशिष्टता प्राप्त करने की अनुमति देती हैं। इसका अर्थ है ठीक उसी सूक्ष्मजीव की पहचान करना जिसकी खोज की गई थी, न कि समान या निकटता से संबंधित।
पीसीआर विधि की नैदानिक ​​​​संवेदनशीलता और विशिष्टता अक्सर संस्कृति पद्धति से अधिक होती है, जिसे संक्रामक रोगों का पता लगाने के लिए "स्वर्ण मानक" कहा जाता है। संस्कृति विकास की अवधि (कई दिनों से कई हफ्तों तक) को ध्यान में रखते हुए, पीसीआर पद्धति का लाभ स्पष्ट हो जाता है।

संक्रमण के निदान में पीसीआर
पीसीआर विधि (संवेदनशीलता और विशिष्टता) के फायदे आधुनिक चिकित्सा में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला निर्धारित करते हैं।
पीसीआर डायग्नोस्टिक्स के आवेदन के मुख्य क्षेत्र:

1. विभिन्न स्थानीयकरण के तीव्र और जीर्ण संक्रामक रोगों का निदान
2. चिकित्सा की प्रभावशीलता की निगरानी
3. रोगज़नक़ के प्रकार का स्पष्टीकरण

पीसीआर का उपयोग प्रसूति, स्त्री रोग, नियोनेटोलॉजी, बाल रोग, मूत्रविज्ञान, रतिजरोग, नेफ्रोलॉजी, संक्रामक रोगों के क्लिनिक, नेत्र विज्ञान, न्यूरोलॉजी, फ़ेथिसियोपल्मोनोलॉजी, आदि में किया जाता है।

पीसीआर डायग्नोस्टिक्स का उपयोग अन्य अनुसंधान विधियों (एलिसा, पीआईएफ, आरआईएफ, आदि) के संयोजन में किया जाता है। उनका संयोजन और समीचीनता उपस्थित चिकित्सक द्वारा निर्धारित किया जाता है।

पीसीआर द्वारा संक्रामक एजेंटों का पता लगाया गया

वायरस:

1. एचआईवी-1 और एचआईवी-2 रेट्रोवायरस
2. हर्पेटिफ़ॉर्म वायरस
3. हरपीज सिंप्लेक्स वायरस टाइप 1 और 2

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)- आणविक जीव विज्ञान में जैव रासायनिक प्रौद्योगिकी की एक विधि है, जिसे डीएनए अंशों की एक या एक से अधिक प्रतियों को कई डिग्री तक बढ़ाने के उद्देश्य से किया जाता है, जो आपको एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम की कई हजार से लाखों प्रतियां बनाने की अनुमति देता है।

कैरी मुलिस द्वारा 1983 में विकसित, पीसीआर विधि अब कई अलग-अलग अनुप्रयोगों के लिए चिकित्सा और जैविक अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली एक आम और अक्सर अपरिहार्य विधि है। इनमें अनुक्रमण के लिए डीएनए क्लोनिंग, डीएनए-आधारित फ़िलेजनी, या जीन के कार्यात्मक विश्लेषण शामिल हैं; निदान वंशानुगत रोग; आनुवंशिक उंगलियों के निशान की पहचान (फोरेंसिक विज्ञान की शाखाओं में और पितृत्व परीक्षण में प्रयुक्त), साथ ही संक्रामक रोगों का पता लगाने और निदान। 1993 में, मुलिस को पीसीआर पर उनके काम के लिए माइकल स्मिथ के साथ रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया था।

विधि थर्मल साइकलिंग पर आधारित है, जिसमें एंजाइमों द्वारा डीएनए को विकृत करने और दोहराने के लिए हीटिंग और कूलिंग प्रतिक्रियाओं के दोहराए गए चक्र शामिल हैं। प्राइमर, (डीएनए के छोटे टुकड़े) जिसमें अनुक्रम होते हैं जो डीएनए पोलीमरेज़ (जिससे विधि का नाम दिया गया है) के साथ लक्ष्य साइट के पूरक हैं, चयनात्मक और पुन: प्रवर्धन को चलाने के लिए प्रमुख घटक हैं। पीसीआर प्रक्रिया में, संश्लेषित डीएनए का उपयोग प्रतिकृति के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया जाता है, गति में एक चेन रिएक्शन सेट करता है जिसमें टेम्पलेट डीएनए तेजी से बढ़ाया जाता है। पीसीआर को प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण रूप से संशोधित किया जा सकता है एक विस्तृत श्रृंखलाआनुवंशिक हेरफेर।

लगभग सभी पीसीआर अनुप्रयोग एक थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करते हैं जैसे टाक पोलीमरेज़, एक एंजाइम जो मूल रूप से बैक्टीरिया से पृथक होता है। थर्मसaquaticus. यह डीएनए पोलीमरेज़ डीएनए के निर्माण खंडों से डीएनए के एक नए स्ट्रैंड को एंजाइमेटिक रूप से इकट्ठा करता है - न्यूक्लियोटाइड्स, एकल-स्ट्रैंडेड डीएनए को एक टेम्पलेट और डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (जिसे डीएनए प्राइमर भी कहा जाता है) के रूप में उपयोग करके डीएनए संश्लेषण शुरू करने के लिए आवश्यक है। अधिकांश पीसीआर विधियां थर्मल साइकलिंग का उपयोग करती हैं, यानी तापमान चरणों की एक निश्चित श्रृंखला पर पीसीआर नमूने के वैकल्पिक हीटिंग और कूलिंग। डीएनए विकृतीकरण नामक प्रक्रिया में उच्च तापमान पर डीएनए डबल हेलिक्स के दो पहलुओं को शारीरिक रूप से अलग करने के लिए इन थर्मल साइकलिंग चरणों की आवश्यकता होती है। कम तापमान पर, लक्ष्य डीएनए क्षेत्र को चुनिंदा रूप से बढ़ाने के लिए डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा डीएनए संश्लेषण में प्रत्येक स्ट्रैंड का उपयोग टेम्पलेट के रूप में किया जाएगा। पीसीआर परिणामों की चयनात्मकता प्राइमरों का उपयोग करती है जो कुछ थर्मल साइकलिंग स्थितियों के तहत प्रवर्धन के लिए लक्ष्य डीएनए क्षेत्र के पूरक हैं।

पीसीआर डायग्नोस्टिक्स के सिद्धांत

पीसीआर का उपयोग डीएनए श्रृंखला (लक्ष्य डीएनए) के एक विशिष्ट खंड को बढ़ाने के लिए किया जाता है। अधिकांश पीसीआर विधियां आमतौर पर ~ 10,000 बेस जोड़े (केबी) तक डीएनए अंशों को बढ़ाती हैं, हालांकि कुछ तरीकों से टुकड़ों को आकार में 40 केबी तक बढ़ाया जा सकता है। प्रतिक्रिया अंतिम प्रवर्धित उत्पाद की एक सीमित मात्रा का उत्पादन करती है, जो प्रतिक्रिया उत्पादों की प्रतिक्रिया और प्रतिक्रिया-निषेध में उपलब्ध अभिकर्मकों द्वारा नियंत्रित होती है।

बुनियादी पीसीआर किट के लिए कई घटकों और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। इसमे शामिल है:

• डीएनए टेम्पलेट, जिसमें प्रवर्धित किए जाने वाले लक्षित डीएनए क्षेत्र शामिल हैं।
• दो प्राइमर,लक्ष्य डीएनए के प्रत्येक सेंस और एंटीसेन्स स्ट्रैंड के 3' सिरों का पूरक।
• टाक पोलीमरेज़या कोई अन्य डीएनए पोलीमरेज़ लगभग 70 डिग्री सेल्सियस के इष्टतम तापमान पर काम कर रहा है।
• डीऑक्सीन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट(dNTPs; न्यूक्लियोटाइड युक्त ट्राइफॉस्फेट समूह), बिल्डिंग ब्लॉक्स जिससे डीएनए पोलीमरेज़ एक नए डीएनए स्ट्रैंड को संश्लेषित करता है।
• बफर द्रावण, के लिए उपयुक्त रासायनिक स्थिति प्रदान करना इष्टतम गतिविधिऔर डीएनए पोलीमरेज़ की स्थिरता।
• द्विसंयोजक धनायन,मैग्नीशियम या मैंगनीज आयन; Mg2+ का आमतौर पर उपयोग किया जाता है, लेकिन Mn2+ का उपयोग PCR-मध्यस्थ डीएनए उत्परिवर्तन के लिए भी किया जा सकता है, क्योंकि Mn2+ की उच्च सांद्रता डीएनए संश्लेषण के दौरान त्रुटि दर को बढ़ाती है।
• मोनोवालेंट केशनपोटेशियम आयन।

पीसीआर आमतौर पर थर्मल साइक्लर-एम्पलीफायर में छोटी प्रतिक्रिया ट्यूबों (वॉल्यूम 0.2-0.5 मिली) में 10-200 μl की प्रतिक्रिया मात्रा में किया जाता है। प्रतिक्रिया के प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक तापमान प्राप्त करने के लिए साइक्लर प्रतिक्रिया ट्यूबों को गर्म और ठंडा करता है। कई आधुनिक साइक्लर पेल्टियर प्रभाव का उपयोग करते हैं, जो विद्युत प्रवाह की दिशा को उलट कर पीसीआर ट्यूब असेंबली को गर्म और ठंडा करने की अनुमति देता है। तेजी से तापीय संतुलन सुनिश्चित करने के लिए पतली दीवार वाली प्रतिक्रिया ट्यूब अनुकूल तापीय चालकता को बढ़ावा देती है। पुराने साइक्लर्स जिनके पास गर्म ढक्कन नहीं है, उन्हें प्रतिक्रिया मिश्रण की सतह पर तेल की एक परत या शीशी में मोम की एक परत की आवश्यकता होती है।

प्रक्रिया का क्रम

आमतौर पर, पीसीआर में 20-40 बार-बार होने वाले तापमान परिवर्तन होते हैं जिन्हें चक्र कहा जाता है, प्रत्येक चक्र में आमतौर पर 2-3 असतत तापमान चरण होते हैं, आमतौर पर तीन। साइकिल चलाना अक्सर एक ही तापमान चरण के साथ शुरू और समाप्त होता है (तथाकथित प्रत्याशा) उत्पाद या लघु भंडारण के अंतिम विस्तार के लिए उच्च तापमान (> 90 डिग्री सेल्सियस) पर। उपयोग किए गए तापमान और प्रत्येक चक्र में उनके आवेदन की अवधि कई मापदंडों पर निर्भर करती है। इनमें डीएनए संश्लेषण के लिए उपयोग किया जाने वाला एंजाइम, प्रतिक्रिया में द्विसंयोजक आयनों और dNTPs की सांद्रता और प्राइमरों का गलनांक (Tm) शामिल हैं।

• प्रारंभिक चरण:इस कदम में प्रतिक्रिया को 94-96 डिग्री सेल्सियस (या 98 डिग्री सेल्सियस यदि अत्यधिक गर्मी-स्थिर पोलीमरेज़ का उपयोग किया जाता है) के तापमान पर गर्म करना शामिल है, जो 1-9 मिनट के लिए किया जाता है। कदम केवल डीएनए पोलीमरेज़ के लिए आवश्यक है जिसके लिए गर्मी सक्रियण की आवश्यकता होती है, तथाकथित हॉट स्टार्ट पीसीआर।
• विकृतीकरण कदम:यह पहली नियमित थर्मल साइकलिंग घटना है और इसमें 20-30 सेकंड के लिए 94-98 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को गर्म करना शामिल है। यह पूरक आधारों के बीच हाइड्रोजन बंधनों के विनाश और एकल-फंसे डीएनए अणुओं के गठन के साथ डीएनए टेम्पलेट की दरार का कारण बनता है।
• एनीलिंग कदम:प्रतिक्रिया तापमान 20-40 सेकंड के लिए 50-65 डिग्री सेल्सियस तक कम हो जाता है, जो प्राइमरों को एकल-फंसे हुए डीएनए टेम्पलेट से बाँधने की अनुमति देता है। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों के टीएम के नीचे एनीलिंग तापमान लगभग 3-5 डिग्री सेल्सियस होता है। स्थिर डीएनए-डीएनए हाइड्रोजन बांड तभी बनते हैं जब प्राइमर अनुक्रम अनुक्रम टेम्पलेट से अधिक निकटता से मेल खाता है। पोलीमरेज़ प्राइमर-टेम्पलेट हाइब्रिड से जुड़ता है और डीएनए संश्लेषण शुरू करता है।
• विस्तार / बढ़ाव चरण:इस चरण के दौरान तापमान उपयोग किए गए डीएनए पोलीमरेज़ पर निर्भर करता है; टैक पोलीमरेज़ का इष्टतम गतिविधि तापमान 75-80 डिग्री सेल्सियस है; इस एंजाइम के लिए आमतौर पर 72 डिग्री सेल्सियस का तापमान उपयोग किया जाता है। इस स्तर पर, डीएनए पोलीमरेज़ dNTPs को जोड़कर एक नए डीएनए स्ट्रैंड को डीएनए टेम्पलेट स्ट्रैंड के पूरक के रूप में संश्लेषित करता है जो 5 "से 3" दिशा में टेम्पलेट के पूरक होते हैं, जो dNTP के 5 "-फॉस्फेट समूह को 3" से जोड़ते हैं। परिणामी (विस्तारित) डीएनए के अंत में हाइड्रॉक्सिल समूह। विस्तार का समय उपयोग किए गए डीएनए पोलीमरेज़ और प्रवर्धित किए जाने वाले डीएनए टुकड़े की लंबाई दोनों पर निर्भर करता है। आमतौर पर, अपने इष्टतम तापमान पर, डीएनए पोलीमरेज़ प्रति मिनट एक हज़ार आधारों को पोलीमराइज़ करता है। इष्टतम परिस्थितियों में, अर्थात्। सब्सट्रेट या अभिकर्मकों को सीमित करने के कारण प्रतिबंधों की अनुपस्थिति में, प्रत्येक विस्तार कदम पर, लक्ष्य डीएनए की मात्रा दोगुनी हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए खंड का एक घातीय (ज्यामितीय) प्रवर्धन होता है।
• अंतिम विस्तार:यह एकमात्र कदम है, कभी-कभी अंतिम पीसीआर चक्र के बाद 5-15 मिनट के लिए 70-74 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई भी शेष एकल-फंसे डीएनए पूरी तरह से विस्तारित हो गया है।
• अंतिम अपेक्षा:प्रतिक्रिया को कम रखने के लिए 4-15 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए इस कदम का उपयोग किया जा सकता है। यह जांचने के लिए कि क्या पीसीआर ने अपेक्षित डीएनए खंड (जिसे कभी-कभी "एम्प्लिमर" या "एम्प्लिकॉन" भी कहा जाता है) को संश्लेषित किया है, पीसीआर उत्पादों को आकार से अलग करने के लिए एग्रोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग किया जाता है। पीसीआर उत्पादों का आकार एक डीएनए सीढ़ी (आण्विक भार मार्कर) के साथ तुलना करके निर्धारित किया जाता है जिसमें पीसीआर उत्पादों के साथ एक जेल पर किए गए ज्ञात आकार के डीएनए टुकड़े होते हैं।

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के चरण

पीसीआर प्रक्रिया को तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है:

1. घातीय प्रवर्धन: प्रत्येक चक्र के दौरान, उत्पाद की मात्रा दोगुनी हो जाती है (100% प्रतिक्रिया दक्षता मानकर)। प्रतिक्रिया बहुत संवेदनशील होती है: केवल थोड़ी मात्रा में डीएनए की आवश्यकता होती है।
2. लेवलिंग स्टेज: प्रतिक्रिया धीमी हो जाती है क्योंकि डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि खो देता है और डीएनटीपी और प्राइमर जैसे अभिकर्मकों की खपत उन्हें सीमित करने का कारण बनती है .
3. पठार: अभिकर्मकों और एंजाइमों की कमी के कारण उत्पाद अब जमा नहीं होता है।

पीसीआर अनुकूलन

व्यवहार में, पीसीआर सफल नहीं हो सकता कई कारण, विशेष रूप से संदूषण के प्रति इसकी संवेदनशीलता के कारण, जो डीएनए उप-उत्पादों के प्रवर्धन का कारण बनता है। इस संबंध में, पीसीआर स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए कई तकनीकों और प्रक्रियाओं का विकास किया गया है। विदेशी डीएनए संदूषण को प्रयोगशाला प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो संभावित डीएनए संदूषकों के प्री-पीसीआर मिश्रण को शुद्ध करते हैं। इसमें आमतौर पर पीसीआर किट को पीसीआर उत्पादों के विश्लेषण या शुद्धिकरण क्षेत्रों से अलग करना, डिस्पोजेबल प्लास्टिक के बर्तनों का उपयोग करना और प्रतिक्रिया चरणों के बीच काम की सतह को अच्छी तरह से साफ करना शामिल है। प्राइमर डिज़ाइन तकनीक पीसीआर उत्पादों के अलगाव में सुधार करने और उप-उत्पादों के गठन से बचने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, और वैकल्पिक बफर घटकों या पोलीमरेज़ एंजाइमों का उपयोग लंबे या अन्यथा समस्याग्रस्त डीएनए क्षेत्रों को बढ़ाने में मदद कर सकता है। बफर सिस्टम में फॉर्मामाइड जैसे अभिकर्मकों को जोड़ने से पीसीआर की विशिष्टता और रिकवरी में वृद्धि हो सकती है। प्राइमर डिजाइन में सहायता के लिए सैद्धांतिक पीसीआर परिणामों (इलेक्ट्रॉनिक पीसीआर) का कंप्यूटर सिमुलेशन किया जा सकता है।

पीसीआर का आवेदन

चयनात्मक डीएनए अलगाव

पीसीआर एक विशिष्ट डीएनए क्षेत्र के चयनात्मक प्रवर्धन द्वारा जीनोमिक डीएनए से डीएनए के टुकड़ों को अलग करने की अनुमति देता है। पीसीआर का यह अनुप्रयोग कई विधियों का पूरक है, जैसे दक्षिणी या उत्तरी सोख्ता और डीएनए क्लोनिंग विधियों के लिए संकरण जांच का निर्माण, जिसके लिए डीएनए के एक विशिष्ट क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करने वाले डीएनए की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। पीसीआर इन तरीकों को शुद्ध डीएनए की एक उच्च सामग्री के साथ प्रदान करता है, जो डीएनए नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देता है, यहां तक ​​कि शुरुआती सामग्री की थोड़ी मात्रा के साथ भी।

पीसीआर के अन्य अनुप्रयोगों में अज्ञात पीसीआर-प्रवर्धित अनुक्रमों की पहचान करने के लिए डीएनए अनुक्रमण शामिल है, जिसमें सेंगर अनुक्रमण में प्रवर्धन प्राइमरों में से एक का उपयोग किया जा सकता है, डीएनए अनुक्रम अलगाव एक प्लास्मिड या आनुवंशिक सामग्री में डीएनए अनुक्रम के सम्मिलन को शामिल करने वाली पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकियों में तेजी लाने के लिए दूसरे जीव का। वेक्टर डीएनए डिजाइन को सही करने के लिए पीसीआर द्वारा बैक्टीरिया (ई. कोलाई) की कॉलोनियों की तेजी से जांच की जा सकती है। पीसीआर का उपयोग जेनेटिक फिंगरप्रिंटिंग के लिए भी किया जा सकता है; विभिन्न पीसीआर विधियों का उपयोग करके प्रायोगिक डीएनए की तुलना करके किसी व्यक्ति या जीव की पहचान करने के लिए फोरेंसिक चिकित्सा में प्रयुक्त तकनीक।

कुछ "फ़िंगरप्रिंट" पीसीआर विधियों में एक उच्च भेदभावपूर्ण शक्ति होती है और इसका उपयोग व्यक्तियों के बीच आनुवंशिक संबंधों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि माता-पिता-बच्चे या भाई-बहनों के बीच, और पितृत्व परीक्षण में उपयोग किया जाता है। जीवों के बीच विकासवादी संबंधों को निर्धारित करने के लिए भी इस तकनीक को लागू किया जा सकता है।

डीएनए प्रवर्धन और मात्रा का ठहराव

चूंकि पीसीआर लक्ष्य डीएनए क्षेत्रों की प्रतिलिपि संख्या को बढ़ाता है, पीसीआर का उपयोग नमूने की बहुत कम मात्रा का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। यह फोरेंसिक जांच के लिए अक्सर महत्वपूर्ण होता है जहां साक्ष्य के रूप में केवल डीएनए की ट्रेस मात्रा ही उपलब्ध होती है। पीसीआर का इस्तेमाल प्राचीन डीएनए का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है जो हजारों साल पुराना है। मिस्र की ममियों के विश्लेषण से लेकर रूसी ज़ार की पहचान तक के अनुप्रयोगों में इन पीसीआर विधियों का 40,000 साल पुराने मैमथ के साथ-साथ मानव डीएनए पर सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है।

मात्रात्मक पीसीआर विधियाँ एक नमूने में मौजूद दिए गए अनुक्रम की मात्रा का अनुमान लगाती हैं, एक विधि जिसका उपयोग अक्सर जीन अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। रीयल-टाइम पीसीआर एक स्थापित डीएनए परिमाणीकरण उपकरण है जो पीसीआर प्रवर्धन के प्रत्येक चक्र के बाद उत्पाद डीएनए के संचय को मापता है।

रोगों के निदान में पीसीआर

पीसीआर ल्यूकेमिया और लिम्फोमा जैसी घातक बीमारियों के शीघ्र निदान की अनुमति देता है, जो वर्तमान में कैंसर अनुसंधान में अत्यधिक विकसित है और पहले से ही नियमित रूप से उपयोग किया जा रहा है। अनुवाद-विशिष्ट का पता लगाने के लिए पीसीआर सीधे जीनोमिक डीएनए नमूनों पर किया जा सकता है घातक कोशिकाएंसंवेदनशीलता के साथ जो अन्य तरीकों की तुलना में कम से कम 10,000 गुना अधिक है।

पीसीआर टिश्यू कल्चर और पशु मॉडल से अनुपजाऊ या धीमी गति से बढ़ने वाले जीवों जैसे कि माइकोबैक्टीरिया, एनारोबिक बैक्टीरिया और वायरस का पता लगाने की भी अनुमति देता है। माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में पीसीआर डायग्नोस्टिक एप्लिकेशन का आधार संक्रामक एजेंटों की पहचान और विशिष्ट जीन के कारण रोगजनकों से गैर-रोगजनक उपभेदों का भेदभाव है।

पीसीआर द्वारा वायरल डीएनए का भी पता लगाया जा सकता है। प्राइमरों को वायरस के लक्ष्य डीएनए अनुक्रमों के लिए विशिष्ट होना चाहिए, और पीसीआर का उपयोग डायग्नोस्टिक डीएनए परीक्षणों या वायरल जीनोम के अनुक्रमण के लिए किया जा सकता है। पीसीआर की उच्च संवेदनशीलता संक्रमण के तुरंत बाद और बीमारी की शुरुआत से पहले ही वायरस का पता लगाना संभव बनाती है। वायरस का यह शुरुआती पता लगाने से डॉक्टरों को उपचार के महत्वपूर्ण विकल्प मिल सकते हैं। एक मरीज में वायरस ("वायरल लोड") की मात्रा मात्रात्मक पीसीआर-आधारित डीएनए विश्लेषण द्वारा भी निर्धारित की जा सकती है।

बुनियादी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन विधियों पर बदलाव

• एलील-विशिष्ट पीसीआर: एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) (डीएनए में एकल आधार अंतर) पर आधारित नैदानिक ​​या क्लोनिंग विधि। डीएनए अनुक्रम के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है, एलील्स के बीच अंतर सहित, और प्राइमरों का उपयोग करता है जिनके 3' समाप्त एसएनपी तक फैले हुए हैं। कड़े पीसीआर प्रवर्धन टेम्पलेट और प्राइमर के बीच एक बेमेल की उपस्थिति में बहुत कम कुशल है, इसलिए एसएनपी-विशिष्ट के साथ सफल प्रवर्धन अनुक्रम में विशिष्ट एसएनपी की उपस्थिति के बारे में प्राइमर संकेत।
• पीसीआर असेंबली या पोलीमरेज़ साइकलिंग असेंबली (पीसीपी):छोटे अतिव्यापी खंडों के साथ लंबे ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के एक पूल पर पीसीआर द्वारा लंबे डीएनए अनुक्रमों का कृत्रिम संश्लेषण। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स सेंस और एंटीसेन्स स्ट्रैंड दिशाओं के बीच वैकल्पिक होते हैं, और अतिव्यापी खंड पीसीआर अंशों के क्रम को निर्धारित करते हैं, जिससे चुनिंदा रूप से अंतिम लंबे डीएनए उत्पाद का निर्माण होता है।
• असममित पीसीआर: अधिमानतः डीएनए के एक स्ट्रैंड को डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए टेम्पलेट में बढ़ाता है। अनुक्रमण और संकरण जांच में उपयोग किया जाता है जहां दो पूरक किस्में में से केवल एक के प्रवर्धन की आवश्यकता होती है। पीसीआर हमेशा की तरह किया जाता है, लेकिन प्रवर्धन के लिए बनाई गई श्रृंखला के लिए प्राइमरों की एक बड़ी मात्रा के साथ। एक सीमित प्राइमर के उपयोग के बाद प्रतिक्रिया के अंत में धीमी (अंकगणितीय प्रगति) प्रवर्धन के कारण, अतिरिक्त पीसीआर चक्रों की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया का नवीनतम संशोधन, जिसे "लेट-पीसीआर" (घातीय चरण के बाद रैखिकता - पीसीआर) के रूप में जाना जाता है, प्रतिक्रिया दक्षता बनाए रखने के लिए प्राइमर अतिरिक्त की तुलना में उच्च पिघलने बिंदु (टीएम) के साथ एक सीमित प्राइमर का उपयोग करता है, क्योंकि सीमित प्राइमर की एकाग्रता घट जाती है प्रतिक्रिया के बीच में।
• डायल-आउट पीसीआर: जीन संश्लेषण के लिए सटीक डीएनए अणु प्राप्त करने के लिए एक अत्यधिक समानांतर विधि। डीएनए अणुओं के जटिल पूल को अनूठे फ्लैंक टैग द्वारा बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण के लिए संशोधित किया गया है। टैग-निर्देशित प्राइमर तब पीसीआर द्वारा अनुक्रमित अणु प्रदान करते हैं।
• हेलिकेज निर्भर प्रवर्धन:पारंपरिक पीसीआर के समान लेकिन विकृतीकरण और एनीलिंग / विस्तार चक्रों के माध्यम से साइकिल चलाने की तुलना में निरंतर तापमान की आवश्यकता होती है। डीएनए हेलिकेज़, एक एंजाइम जो डीएनए को खोल देता है, का उपयोग गर्मी विकृतीकरण के बजाय किया जाता है।
• हॉट स्टार्ट पीसीआर: एक तकनीक जो पीसीआर चरणों के प्रारंभिक सेटअप के दौरान गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को कम करती है। पोलीमरेज़ जोड़ने से पहले प्रतिक्रिया घटकों को विकृतीकरण तापमान (जैसे 95 डिग्री सेल्सियस) पर गर्म करके मैन्युअल रूप से किया जा सकता है। विशिष्ट एंजाइम सिस्टम विकसित किए गए हैं जो कमरे के तापमान पर पोलीमरेज़ गतिविधि को रोकते हैं, या तो एंटीबॉडी बंधन से या सहसंयोजक बाध्य अवरोधकों की उपस्थिति में जो उच्च तापमान सक्रियण चरण के बाद ही अलग हो जाते हैं। हॉट स्टार्ट/कोल्ड फिनिश पीसीआर को नए हाइब्रिड पोलीमरेज़ के साथ हासिल किया जाता है जो परिवेश के तापमान पर निष्क्रिय होते हैं और बढ़ाव तापमान पर तुरंत सक्रिय हो जाते हैं।
• इंटरमाइक्रोसेटेलाइट अनुक्रम विशिष्ट पीसीआर (आईएसएसआर):पीसीआर डीएनए फिंगरप्रिंटिंग विधि जो प्रवर्धित टुकड़े की लंबाई से एक अद्वितीय फिंगरप्रिंट प्राप्त करने के लिए सरल दोहराव अनुक्रमों के बीच क्षेत्रों की प्रतिलिपि संख्या को बढ़ाती है।
• उल्टे पीसीआरव्यापक रूप से जीनोमिक आवेषण के आसपास अनुक्रम क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इसमें डीएनए विखंडन और स्व-बंधाव की एक श्रृंखला शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप अज्ञात अनुक्रम के दोनों छोर पर ज्ञात अनुक्रम होते हैं।
• बंधाव द्वारा मध्यस्थता पीसीआर:रुचि के डीएनए से जुड़े छोटे डीएनए लिंकर्स और डीएनए लिंकर्स से जुड़े कुछ प्राइमरों का उपयोग करता है; डीएनए अनुक्रमण, जीनोम वॉकिंग और डीएनए फुटप्रिंटिंग के लिए उपयोग किया जाता है।
• मिथाइलेशन-विशिष्ट पीसीआर(एमएसपी): जॉन्स हॉपकिन्स स्कूल ऑफ मेडिसिन में स्टीफन बेलीन और जिम हरमन द्वारा विकसित, इसका उपयोग जीनोमिक डीएनए में सीपीजी द्वीपों के मिथाइलेशन का पता लगाने के लिए किया जाता है। डीएनए को पहले सोडियम बाइसल्फ़ाइट के साथ इलाज किया जाता है, जो अनमेथिलेटेड साइटोसिन बेस को यूरैसिल में परिवर्तित करता है, जिसे पीसीआर प्राइमरों द्वारा थाइमिन के रूप में पहचाना जाता है। प्राइमर अनुक्रम के भीतर किसी भी CpG द्वीप को छोड़कर समान प्राइमरों के सेट का उपयोग करके संशोधित डीएनए पर दो पीसीआर का प्रदर्शन किया जाता है। इन बिंदुओं पर, प्राइमरों का एक सेट डीएनए को मिथाइलेटेड डीएनए की कॉपी संख्या बढ़ाने के लिए साइटोसिन के साथ पहचानता है, और एक सेट यूरेसिल या थाइमिन के साथ डीएनए को अनमेथिलेटेड डीएनए को बढ़ाने के लिए पहचानता है। मिथाइलेशन पर गुणात्मक जानकारी के बजाय मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए क्यूपीसीआर का उपयोग कर एमएसपी भी किया जा सकता है।
• मिनिप्रीमर - पीसीआर:थर्मोस्टेबल पोलीमरेज़ (S-Tbr) का उपयोग किया जाता है, जो 9 या 10 न्यूक्लियोटाइड्स की संख्या के साथ छोटे प्राइमरों ("स्मॉलिगोस") से बढ़ सकता है। यह तकनीक पीसीआर को छोटे प्राइमरों से जुड़े क्षेत्रों को लक्षित करने की अनुमति देती है और इसका उपयोग 16S (या यूकेरियोटिक 18S) rRNA जीन जैसे संरक्षित डीएनए अनुक्रमों को बढ़ाने के लिए किया जाता है।
• मल्टीप्लेक्स बंधाव निर्भर जांच प्रवर्धन (एमएलपीए): केवल एक जोड़ी प्राइमरों के साथ कई लक्ष्यों के प्रवर्धन की अनुमति देता है, इस प्रकार मल्टीप्लेक्स पीसीआर की रिज़ॉल्यूशन सीमाओं से बचा जाता है।
• मल्टीप्लेक्स पीसीआरविभिन्न डीएनए अनुक्रमों के लिए विशिष्ट विभिन्न आकारों के एम्पलीकॉन्स प्राप्त करने के लिए एक पीसीआर मिश्रण में प्राइमरों के कई सेट होते हैं। एक ही समय में कई जीनों पर ध्यान केंद्रित करके, एक ही परीक्षण के दौरान अतिरिक्त जानकारी प्राप्त करना संभव है, अन्यथा इसे पूरा करने के लिए कई गुना अधिक अभिकर्मकों और अधिक समय की आवश्यकता होगी। प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए एनीलिंग तापमान को एक ही प्रतिक्रिया के भीतर और एम्प्लिकॉन आकारों के साथ सही ढंग से काम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यही है, जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा देखे जाने पर अलग-अलग बैंड बनाने के लिए उनकी आधार जोड़ी लंबाई पर्याप्त रूप से भिन्न होनी चाहिए।
• नेस्टेड पीसीआर: गैर-विशिष्ट डीएनए प्रवर्धन के कारण पृष्ठभूमि को कम करके, डीएनए प्रवर्धन की विशिष्टता को बढ़ाता है। लगातार दो पीसीआर में प्राइमर के दो सेट का इस्तेमाल किया जाता है। पहली प्रतिक्रिया में, प्राइमरों की एक जोड़ी का उपयोग डीएनए उत्पादों को संश्लेषित करने के लिए किया जाता है, जो अभीष्ट उद्देश्य के अतिरिक्त, गैर-विशेष रूप से प्रवर्धित डीएनए अंशों से मिलकर बना हो सकता है। इसके बाद उत्पादों को एक प्राइमर सेट के साथ दूसरे पीसीआर में उपयोग किया जाता है, जिसकी बाध्यकारी साइटें पहली प्रतिक्रिया में उपयोग किए गए प्रत्येक प्राइमर के 3' सिरों से पूरी तरह या आंशिक रूप से अलग होती हैं। नेस्टेड पीसीआर अक्सर विशेष रूप से लंबे डीएनए अंशों को बढ़ाने में अधिक सफल होता है। पारंपरिक पीसीआर, लेकिन इसके लिए लक्ष्य अनुक्रमों के अधिक विस्तृत ज्ञान की आवश्यकता होती है।
• अतिव्यापी एक्सटेंशन के साथ पीसीआरया अतिव्यापी एक्सटेंशन के साथ splicing(SOE): एक जेनेटिक इंजीनियरिंग तकनीक जिसका उपयोग डीएनए के दो या दो से अधिक टुकड़ों को जोड़ने के लिए किया जाता है जिसमें पूरक अनुक्रम होते हैं। अनुक्रम या उत्परिवर्तन को नियंत्रित करने वाले जीन वाले डीएनए के टुकड़ों को जोड़ने के लिए उपयोग किया जाता है; तकनीक विशिष्ट और लंबे डीएनए निर्माणों के निर्माण की अनुमति देती है।
• मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर):पीसीआर उत्पाद (आमतौर पर वास्तविक समय में) की मात्रा को मापने के लिए उपयोग किया जाता है। डीएनए, सीडीएनए या आरएनए की प्रारंभिक मात्रा की मात्रा निर्धारित करता है। एक नमूने में डीएनए अनुक्रम की उपस्थिति और नमूने में इसकी प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने के लिए क्यूपीसीआर का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। रीयल-टाइम क्वांटिटेटिव पीसीआर में बहुत उच्च स्तर की सटीकता होती है। क्यूआरटी-पीसीआर (या क्यूएफ-पीसीआर) विधियां वास्तविक समय में प्रवर्धित उत्पाद की मात्रा को मापने के लिए साइब्र ग्रीन, ईवाग्रीन, या फ्लोरोफोर युक्त डीएनए जांच जैसे टाकमैन जैसे फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करती हैं। कभी-कभी आरटी-पीसीआर (वास्तविक समय पीसीआर) या आरक्यू-पीसीआर के रूप में संदर्भित किया जाता है। क्यूआरटी-पीसीआर या आरटीक्यू-पीसीआर अधिक उपयुक्त संक्षेप हैं क्योंकि आरटी-पीसीआर आमतौर पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर को संदर्भित करता है जो अक्सर क्यूपीसीआर के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है।
• रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर):आरएनए से डीएनए की प्रतिलिपि संख्या बढ़ाने के लिए। रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस आरएनए को सीडीएनए में बदल देता है, जिसे बाद में पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जाता है। आरटी-पीसीआर व्यापक रूप से जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग में उपयोग किया जाता है या आरएनए प्रतिलेख के अनुक्रम को निर्धारित करने के लिए प्रतिलेखन प्रारंभ और स्टॉप साइट्स सहित होता है। यदि जीन का जीनोमिक डीएनए अनुक्रम ज्ञात है, तो आरटी-पीसीआर का उपयोग जीन में एक्सॉन और इंट्रॉन के स्थान को मैप करने के लिए किया जा सकता है। जीन का 5' छोर (प्रतिलेखन प्रारंभ स्थल के अनुसार) आमतौर पर RACE-PCR (सीडीएनए सिरों का तीव्र प्रवर्धन) द्वारा निर्धारित किया जाता है।
• ठोस चरण पीसीआर: "पोलोनिया एम्प्लीफिकेशन" (उदाहरण के लिए, जहां कॉलोनियों का पीसीआर एक जेल मैट्रिक्स पर बनाया जाता है), "ब्रिज पीसीआर" (प्राइमर्स सहसंयोजक रूप से एक ठोस समर्थन सतह से बंधे होते हैं), पारंपरिक ठोस चरण पीसीआर (जहां "असममित) सहित कई अर्थ शामिल हैं पीसीआर" का उपयोग उन प्राइमरों की उपस्थिति में किया जाता है जो जलीय प्राइमरों में से एक के अनुरूप अनुक्रम के साथ एक ठोस समर्थन करते हैं), और ठोस चरण पीसीआर (जहां पारंपरिक ठोस चरण पीसीआर को उच्च टीएम और नेस्टेड ठोस-समर्थन प्राइमरों का उपयोग करके बेहतर बनाया जा सकता है) फर्म समर्थन के साथ प्राइमरों के गठन को बढ़ावा देने के लिए थर्मल "स्टेप" लगाने का विकल्प)।
• थर्मल असममित इंटरलीव्ड पीसीआर (टेल-पीसीआर):ज्ञात अनुक्रम के बाद अज्ञात अनुक्रम को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक ज्ञात अनुक्रम में, टेल-पीसीआर विभिन्न एनीलिंग तापमान वाले प्राइमरों की नेस्टेड जोड़ी का उपयोग करता है; प्राइमर पतित का उपयोग अज्ञात अनुक्रम से भिन्न दिशा में प्रवर्धित करने के लिए किया जाता है।
• टचडाउन पीसीआर (स्टेप पीसीआर):पीसीआर चक्र प्रगति के रूप में एनीलिंग तापमान को धीरे-धीरे कम करके गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि को कम करने के उद्देश्य से एक पीसीआर संस्करण। प्रारंभिक चक्रों पर एनीलिंग तापमान आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों के टीएम से कुछ डिग्री (3-5 डिग्री सेल्सियस) ऊपर होता है, जबकि बाद के चक्रों में तापमान टीएम के टीएम से कुछ डिग्री (3-5 डिग्री सेल्सियस) नीचे होता है। प्राइमर। उच्च तापमान प्राइमर बाइंडिंग के लिए अधिक विशिष्टता देते हैं, और कम तापमान प्रारंभिक चक्रों के दौरान उत्पन्न विशिष्ट उत्पादों से अधिक कुशल प्रवर्धन की अनुमति देते हैं।
• पैन-एसी: प्रवर्धन के लिए इज़ोटेर्मल स्थितियों का उपयोग करता है और इसे जीवित कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है।
• यूनिवर्सल त्वरित जीनोम के माध्यम से चलते हैं: पारंपरिक "एक तरफा" दृष्टिकोणों की तुलना में अधिक विशिष्ट "दो तरफा" पीसीआर का उपयोग करके जीनोम चलने और आनुवंशिक फिंगरप्रिंटिंग के लिए (केवल एक जीन-विशिष्ट प्राइमर और एक सामान्य प्राइमर का उपयोग करके - जो कृत्रिम "शोर" पैदा कर सकता है) तंत्र के कारण , एक लासो संरचना के गठन सहित। UFW के सरलीकृत डेरिवेटिव हैं "लेन रेज" (जीनोम डीएनए सिरों के तेजी से प्रवर्धन के लिए लासो नेस्टेड पीसीआर), "5" रेस लेन और "3" रेस लेन।
• मेंसिलिकोपीसीआर(डिजिटल पीसीआर, वर्चुअल पीसीआर, ई-पीसीआर, ई-पीसीआर) एक सैद्धांतिक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के परिणामों की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कम्प्यूटेशनल टूल को संदर्भित करता है, जो अनुक्रमित जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम से डीएनए अनुक्रमों को बढ़ाने के लिए प्राइमरों (जांच) के दिए गए सेट का उपयोग करता है।

पीसीआर का इतिहास

1971 के जर्नल ऑफ मॉलिक्यूलर बायोलॉजी लेख में, क्लेपे एट अल ने इन विट्रो स्थितियों के तहत प्राइमरों के साथ एक लघु डीएनए टेम्पलेट को दोहराने के लिए एंजाइमैटिक परख का उपयोग करके पहली बार एक विधि का वर्णन किया। हालांकि, पीसीआर के मूल सिद्धांत की इस शुरुआती अभिव्यक्ति पर ज्यादा ध्यान नहीं दिया गया और 1983 में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के आविष्कार का श्रेय आमतौर पर कैरी मुलिस को दिया जाता है।

जब मुलिस ने 1983 में पीसीआर विकसित किया, तो वह प्रारंभिक बायोटेक कंपनी सेटस कॉर्पोरेशन के लिए एमरीविले, कैलिफोर्निया में काम कर रहे थे। वहां वे छोटी डीएनए श्रृंखलाओं के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार थे। मुलिस ने लिखा है कि एक रात अपनी कार में पैसिफ़िक कोस्ट हाइवे पर गाड़ी चलाते समय उन्होंने पीसीआर की कल्पना की। उन्होंने अपने दिमाग में डीएनए में परिवर्तन (म्यूटेशन) का विश्लेषण करने के लिए एक नया तरीका खेला, जब उन्होंने महसूस किया कि उन्होंने डीएनए पोलीमरेज़ के कारण बार-बार दोहराए जाने वाले चक्रों के माध्यम से डीएनए के किसी भी भाग की कॉपी संख्या बढ़ाने के लिए एक विधि का आविष्कार किया था। वैज्ञानिक अमेरिकी में, मुलिस ने प्रक्रिया को संक्षेप में बताया: "डीएनए आनुवंशिक सामग्री के एक अणु से शुरू करके, पीसीआर एक दिन में 100 अरब ऐसे अणु उत्पन्न कर सकता है। यह प्रतिक्रिया करना आसान है। इसके लिए एक परखनली, कुछ सरल अभिकर्मकों और ऊष्मा स्रोत से अधिक की आवश्यकता नहीं है।" उन्हें उनके आविष्कार के लिए 1993 में रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया था, सात साल बाद जब उन्होंने और उनके सहयोगियों ने सीटस में पहली बार अपने प्रस्ताव को व्यवहार में लाया। हालांकि, मुलिस के काम में अन्य वैज्ञानिकों के बौद्धिक और व्यावहारिक योगदान के बारे में कुछ विवाद बना हुआ है, और क्या वह पीसीआर सिद्धांत का एकमात्र आविष्कारक था।

पीसीआर विधि एक उपयुक्त डीएनए पोलीमरेज़ के उपयोग पर आधारित है जो प्रत्येक प्रतिकृति चक्र के बाद डीएनए डबल हेलिक्स में डीएनए के दो स्ट्रैंड्स को क्लीव करने के लिए आवश्यक> 90 ° C (194 ° F) के उच्च तापमान को झेलने में सक्षम है। मूल रूप से इन विट्रो प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएनए पोलीमरेज़, पीसीआर द्वारा पूर्वाभासित, इतने उच्च तापमान का सामना करने में सक्षम नहीं थे। इसलिए, प्रारंभिक डीएनए प्रतिकृति प्रक्रियाएं बहुत अक्षम और समय लेने वाली थीं, और पूरी प्रक्रिया में बड़ी मात्रा में डीएनए पोलीमरेज़ और निरंतर प्रसंस्करण की आवश्यकता थी।

1976 में टैक पोलीमरेज़ की खोज, थर्मोफिलिक जीवाणु से अलग किया गया एक डीएनए पोलीमरेज़, थर्मसaquaticus, जो स्वाभाविक रूप से गर्म (50 से 80°C (122 से 176°F)) वातावरण जैसे गर्म झरनों में रहता है, ने PCR पद्धति में एक नाटकीय सुधार का मार्ग प्रशस्त किया। डीएनए पोलीमरेज़ से अलग किया गया टी।जलीय, उच्च तापमान पर स्थिर है और डीएनए विकृतीकरण के बाद भी सक्रिय रहता है, इस प्रकार प्रत्येक चक्र के बाद नए डीएनए पोलीमरेज़ जोड़ने की आवश्यकता समाप्त हो जाती है। इसने थर्मल साइक्लर के आधार पर डीएनए प्रवर्धन की प्रक्रिया को स्वचालित करना संभव बना दिया।

पेटेंट युद्ध

प्रस्तावित पीसीआर पद्धति को कैरी मुलिस द्वारा पेटेंट कराया गया था और इसे सीटस कॉर्पोरेशन को श्रेय दिया जाता है जहां मुलिस ने काम किया था जब उन्होंने 1983 में तकनीक का आविष्कार किया था। Taq पोलीमरेज़ एंजाइम को भी पेटेंट द्वारा संरक्षित किया गया है। कार्यप्रणाली से संबंधित कई हाई-प्रोफाइल मुकदमे हुए हैं, जिसमें ड्यूपॉन्ट द्वारा दायर एक असफल मुकदमा भी शामिल है। फार्मास्युटिकल कंपनी हॉफमैन-ला रोचे ने 1992 में पेटेंट के अधिकार हासिल कर लिए थे और वर्तमान में उनके पास हैं जो अभी भी संरक्षित हैं।

Taq पोलीमरेज़ एंजाइम पर एक समान पेटेंट लड़ाई अभी भी Roche और Promega के बीच दुनिया भर के कुछ न्यायालयों में चल रही है। कानूनी दलीलें मूल PCR और Taq पोलीमरेज़ पेटेंट की शर्तों से परे चली गईं, जो 28 मार्च, 2005 को समाप्त हो गईं।

अक्सर वायरस के संकेत और पहचान के लिए एक तीव्र विधि के रूप में उपयोग किया जाता है।

इस पद्धति को पहली बार 1983 में सी. मुलिस (यूएसए) द्वारा विकसित किया गया था। इसकी उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता और कार्यान्वयन में आसानी के कारण, इसका व्यापक रूप से आनुवंशिकी, फोरेंसिक चिकित्सा, निदान और अन्य क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है।

विधि का सार प्रवर्धन है, अर्थात, इन विट्रो में डीएनए अणु के कड़ाई से परिभाषित अंशों की प्रतियों की संख्या में वृद्धि। इस पद्धति में, मैट्रिक्स तंत्र और पूरकता का सिद्धांत काम करता है। दो सिंगल पॉलीन्यूक्लियोटाइड चेन (न्यूक्लिक एसिड) एक डबल-स्ट्रैंडेड चेन में हाइड्रोजन बॉन्डिंग में सक्षम हैं यदि एक के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम दूसरे के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम से बिल्कुल मेल खाते हैं ताकि उनके नाइट्रोजनस बेस एडेनिन-थाइमिन और गुआनिन-साइटोसिन जोड़े बना सकें।

पीसीआर एक थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके डीएनए प्रवर्धन पर आधारित है, जो दो प्राइमरों से शुरू होने वाले परस्पर पूरक डीएनए किस्में को संश्लेषित करता है। एक प्राइमर डीएनए का एक टुकड़ा है जिसमें 20-30 न्यूक्लियोटाइड होते हैं। ये प्राइमर (प्राइमर) डीएनए के विपरीत स्ट्रैंड के पूरक हैं। डीएनए संश्लेषण के दौरान, प्राइमरों को नए संश्लेषित डीएनए अणुओं की श्रृंखला में डाला जाता है।

आमतौर पर पीसीआर को 25-40 चक्रों में सेट किया जाता है। प्रत्येक चक्र में तीन चरण शामिल हैं: पहला 92-95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण है। इस मामले में, डीएनए के दो सूत्र अलग हो जाते हैं; दूसरा - एनीलिंग, या 50-65 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमरों को जोड़ना; तीसरा 68-72 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाव या पोलीमराइज़ेशन है, जबकि डीएनए पोलीमरेज़ चार प्रकार के न्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके डीएनए टेम्पलेट श्रृंखलाओं के पूरक समापन को पूरा करता है। एक चक्र के परिणामस्वरूप, वांछित अनुवांशिक सामग्री दोगुनी हो जाती है। पहले चक्र में बने डीएनए स्ट्रैंड्स दूसरे चक्र के लिए टेम्प्लेट के रूप में काम करते हैं, और इसी तरह पहले चक्र के बाद, केवल दो प्राइमरों के बीच के टुकड़े को बढ़ाया जाता है। इस प्रकार, प्रवर्धित क्षेत्र की प्रतियों की संख्या दोगुनी हो रही है, जो 25-40 चक्रों में लाखों (2 n) डीएनए अंशों को संश्लेषित करना संभव बनाता है - विभिन्न तरीकों से उन्हें इंगित करने के लिए पर्याप्त मात्रा (संकरण जांच की विधि से युक्त) एक निश्चित लेबल, वैद्युतकणसंचलन, आदि)। अधिक बार, इस उद्देश्य के लिए एथिडियम ब्रोमाइड धुंधला के साथ agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग किया जाता है।

पीसीआर में, प्राइमरों का उपयोग रोगज़नक़ के डीएनए के वर्गों से किया जाता है, जिसमें एक अद्वितीय न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम होता है जो केवल एक विशेष रोगज़नक़ के लिए होता है।

पीसीआर को स्थापित करने की विधि इस प्रकार है: एक डीएनए टेम्पलेट को परीक्षण सामग्री से अलग किया जाता है; पृथक डीएनए को एक परखनली में एक प्रवर्धन मिश्रण के साथ जोड़ा जाता है, जिसमें डीएनए पोलीमरेज़, सभी 4 प्रकार के न्यूक्लियोटाइड, 2 प्रकार के प्राइमर, MgCl, बफर, विआयनीकृत पानी और खनिज तेल शामिल हैं। फिर ट्यूबों को साइक्लर में रखा जाता है, और रोगज़नक़ के प्रकार के अनुरूप दिए गए प्रोग्राम के अनुसार स्वचालित मोड में प्रवर्धन किया जाता है। एथिडियम ब्रोमाइड की उपस्थिति में 1-2% agarose जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा परिणाम अधिक बार दर्ज किए जाते हैं, जो डीएनए के टुकड़ों के साथ जुड़ते हैं और चमकदार बैंड के रूप में पहचाने जाते हैं जब जेल एक ट्रांसिल्यूमिनेटर पर यूवी किरणों से विकिरणित होता है। सभी पीसीआर प्रक्रियाओं में 1-2 कार्य दिवस लगते हैं।

पीसीआर की विशिष्टता और संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए, विभिन्न विकल्प: नेस्टेड पीसीआर; मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ पोलीमरेज़ की सक्रिय साइटों की पैराफिन परत या नाकाबंदी का उपयोग करके "हॉट स्टार्ट" के साथ पीसीआर। इसके अलावा, कुछ कंपनियां डीएनए प्रवर्धन के लिए लियोफिलाइज्ड किट का उत्पादन करती हैं, जो पीसीआर प्रक्रिया को तेज करती हैं और गलत सकारात्मक परिणामों की संभावना को कम करती हैं।

वर्तमान में क्रियान्वित किया जा रहा है नई टेक्नोलॉजीवास्तविक समय में पीसीआर-पीसीआर (वास्तविक समय पीसीआर)। इसकी मौलिक विशेषता पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन उत्पादों के संचय की निगरानी और मात्रात्मक विश्लेषण और प्राप्त परिणामों की स्वचालित पंजीकरण और व्याख्या है। इस विधि में वैद्युतकणसंचलन कदम की आवश्यकता नहीं होती है, जो पीसीआर के लिए प्रयोगशाला आवश्यकताओं को कम करता है। वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन के दौरान डीएनए का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच का उपयोग करता है। रीयल-टाइम पीसीआर 20-60 मिनट के भीतर एक नमूने के पूर्ण विश्लेषण की अनुमति देता है और सैद्धांतिक रूप से एक नमूने में एक डीएनए या आरएनए अणु का पता लगाने का एक तरीका है।

वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर की निगरानी) में उत्पाद का पता लगाने की प्रणाली आपको चक्र द्वारा प्रवर्धित डीएनए चक्र के संचय की निगरानी करने की अनुमति देती है। प्रणाली में एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच शामिल है जो लक्ष्य डीएनए के एक आंतरिक खंड को संलग्न करने (संकरण) करने में सक्षम है। 5' छोर पर, जांच को एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर डाई के साथ और 3' छोर पर एक अवरोधक (क्वेंचर डाई) के साथ लेबल किया जाता है। जैसे ही पीसीआर उत्पाद जमा होता है, जांच उसमें संकरित हो जाती है, लेकिन रिपोर्टर और अवरोधक के बीच निकटता के कारण कोई चमक नहीं होती है। अनुक्रम की नकल करने के परिणामस्वरूप, पोलीमरेज़ जांच के 5' छोर तक पहुँच जाता है। पोलीमरेज़ की 5'-3'-एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि जांच के 3'-अंत से फ्लोरोसेंट लेबल को अलग कर देती है, जिससे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सिग्नल ब्लॉकर के साथ अपने जुड़ाव से मुक्त हो जाता है, जिससे प्रतिदीप्ति में वृद्धि होती है। प्रतिदीप्ति का स्तर इस प्रकार विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पाद की मात्रा के समानुपाती होता है। यह महत्वपूर्ण है कि पीसीआर के परिणाम बंद ट्यूबों में प्रतिदीप्ति की उपस्थिति से दर्ज किए जाते हैं और इस प्रकार, इस विधि की मुख्य समस्याओं में से एक हल हो जाती है - एम्प्लिकॉन संदूषण की समस्या।

पीसीआर के लाभ: तेज विश्लेषण; उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता; अध्ययन सामग्री की न्यूनतम मात्रा; कार्यान्वयन में आसानी और पूर्ण स्वचालन की संभावना।

चूंकि पीसीआर टेम्पलेट डीएनए की एक प्रति का पता लगाने जितना संवेदनशील हो सकता है, इसलिए गलत सकारात्मक परिणामों का उच्च जोखिम होता है। इसलिए, पीसीआर की स्थापना करते समय, एक आनुवंशिक निदान प्रयोगशाला को लेआउट और संचालन के तरीके के लिए विशेष आवश्यकताओं का लगातार पालन करना चाहिए।

पीसीआर उन पूरक विधियों में से एक है जो वायरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक्स में मौजूद हैं। निदान के लिए यह प्रतिक्रिया बहुत महत्वपूर्ण है विषाणु संक्रमणजब वायरल एंटीजन या वायरस-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता नहीं लगाया जा सकता है और जब वायरल न्यूक्लिक एसिड की उपस्थिति संक्रमण का एकमात्र प्रमाण हो सकती है, विशेष रूप से अव्यक्त और मिश्रित संक्रमणों में।

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